Visualisation par fluorescence d’une seule molécule de la dynamique de l’ADN polymérase au niveau des G-quadruplexes

Ce protocole décrit un test de réplication de l’ADN à molécule unique basé sur la microscopie à fluorescence, permettant de visualiser en temps réel les interactions entre les ADN polymérases et les obstacles tels que les structures G-quadruplex.

La capacité des protéines impliquées dans la réplication de l’ADN eucaryote à surmonter les obstacles – tels que les « barrages routiers » des protéines et de l’ADN – est essentielle pour assurer une duplication fidèle du génome. Les G-quadruplexes sont des structures d’acides nucléiques d’ordre supérieur qui se forment dans les régions riches en guanine de l’ADN et il a été démontré qu’elles agissent comme des obstacles, interférant avec les voies de maintenance génomique. Cette étude présente une méthode en temps réel, basée sur la microscopie à fluorescence, pour observer les interactions de l’ADN polymérase avec les structures G-quadruplex. Des oligonucléotides d’ADN courts et amorcés contenant un G-quadruplex ont été immobilisés sur des lamelles en verre fonctionnalisées à l’intérieur d’une cellule d’écoulement microfluidique. Des ADN polymérases marquées par fluorescence ont été introduites, ce qui a permis de surveiller leur comportement et leur stœchiométrie au fil du temps. Cette approche a permis d’observer le comportement de la polymérase alors qu’elle était bloquée par un G-quadruplex. Plus précisément, en utilisant des δ de levure polymérase marquées par fluorescence, il a été constaté que lors de la rencontre d’un G-quadruplex, la polymérase subit un cycle continu de liaison et de déliaison. Ce test à molécule unique peut être adapté pour étudier les interactions entre diverses protéines de maintien de l’ADN et les obstacles sur le substrat de l’ADN.

Les ADN polymérases sont des enzymes qui catalysent l’incorporation de nucléosides triphosphates pour dupliquer l’ADN 1,2,3,4,5. En tant que tels, ils jouent un rôle clé dans les processus essentiels de maintenance de l’ADN, y compris la réplication^de l’ADN ^6,7,8 et la réparation 9,10,11,12. Les ADN polymérases doivent répliquer le génome avec précision et efficacité pour garantir l’intégrité génomique, empêchant ainsi l’accumulation de mutations dans le génome. Au cours de la synthèse, les polymérases rencontrent souvent des « obstacles » tels que des protéines liées à l’ADN ou des structures secondaires de l’ADN¹³. Ces obstacles peuvent ralentir, voire bloquer, la progression de la polymérase¹⁴. Il est important de surmonter ces obstacles pour assurer une duplication fidèle du génome, car le non-respect de cette méthode peut entraîner une instabilité génomique^15,16.

Les G-quadruplexes (G4), des structures d’ADN secondaires non canoniques dont il a été démontré qu’elles se forment dans des séquences riches en guanine au sein du génome humain¹⁷. Il existe plus de 700 000 séquences différentes dans le génome humain capables de former un G4, y compris des régions à l’intérieur des télomères et des promoteurs d’oncogènes¹⁸. Ces structures d’ADN adoptent diverses conformations en fonction de la séquence nucléotidique, de la longueur et du cation métallique^lié 19,20,21. Cette diversité signifie que les polymérases doivent surmonter une gamme de topologies G4 différentes, potentiellement avec des degrés d’efficacité variables. Il a été démontré que l’incapacité des polymérases à surmonter ou à contourner une structure G4 entrave la progression de la fourche de réplication in vivo, conduisant à une instabilité génomique²². Des études in vitro ont montré que les structures G4 peuvent bloquer ou bloquer complètement les polymérases^{de levure} 23,24,25,26,27. La capacité des structures G4 à bloquer ou à bloquer les ADN polymérases dépend entièrement de leur stabilité cinétique et thermodynamique, certaines polymérases étant capables de déplier certains²⁸ de G4. Bien que ces études donnent un aperçu de la capacité des polymérases à surmonter les obstacles G-quadruplex, elles n’ont pas la capacité de visualiser directement le comportement de la polymérase lorsqu’elle rencontre une G4. Le destin des polymérases - qu’elles restent liées, tombent ou s’échangent dynamiquement - détermine quels processus en aval sont accessibles pour résoudre le G4.

Dans cette étude, un test de microscopie à molécule unique basé sur la fluorescence a été mis au point pour visualiser et surveiller directement la liaison de l’ADN polymérase avec les structures G4 en temps réel. Ce test consiste à attacher des matrices d’ADN formant G4 à une lamelle biotinylée dans une cellule d’écoulement microfluidique, où des ADN polymérases marquées par fluorescence peuvent être introduites pour initier la synthèse de l’ADN. En mesurant la fluorescence des polymérases au cours du temps, leur comportement lors de la rencontre avec une structure G4 peut être directement observé. La structure G4 trouvée dans l’oncogène cancéreux c-MYC a été choisie pour ce test en raison de son haut niveau de stabilité. Ce protocole peut maintenant être adapté pour cataloguer le comportement d’une variété de polymérases dans tous les domaines de la vie associés à différentes topologies et stabilités G4. Ce test offre une approche innovante et à haut débit pour élucider les mécanismes par lesquels les ADN polymérases naviguent les obstacles de l’ADN, fournissant un outil puissant pour faire progresser la compréhension de la dynamique de la polymérase.

Les détails des réactifs et de l’équipement utilisé sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Spectroscopie circulaire du dichroïsme

REMARQUE : Avant de mettre au point le test, il était nécessaire d’effectuer une spectroscopie de dichroïsme circulaire (CD) sur la séquence G4 sélectionnée pour assurer un repliement correct. La séquence 22 nt (5'-TGAGGGTGGGGGGGGGGGGG-3') forme la structure G4 dérivée de l’oncogène cancéreux c-MYC . La spectroscopie CD a également été réalisée sur une séquence de contrôle (5′- TGAGTGTGAAGACGATGATGAGAA -3) dont les nucléotides clés sont modifiés pour empêcher la formation de G4.

1. Pour préparer les matrices d’ADN pour la spectroscopie CD, ajoutez 40 μL de 100 μM des matrices de 22 nt à 360 μL de tampon Tris-HCl (pH 8,0), d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) (TE) complété par 200 mM de chlorure de potassium (KCl). Une concentration finale d’ADN de 10 μM est souhaitée pour les expériences de spectroscopie CD.
   REMARQUE : La présence d’ions K⁺ est essentielle pour stabiliser la structure G4 dans le modèle.
2. Chauffer les solutions d’ADN à 95 °C dans un bain sec numérique pendant 15 min. Une fois terminé, refroidissez lentement les solutions pendant la nuit en plaçant le bloc chauffant dans du polystyrène. Ce lent processus de refroidissement est responsable du pliage du G4.
3. Transvaser 400 μL des solutions de formation et de séquence de contrôle G4 dans une cuvette en quartz de 0,1 cm de longueur à l’aide d’une seringue étanche au gaz. Remplissez lentement la cuvette pour éviter la formation de bulles d’air.
4. Mesurez le spectre CD entre 200 nm et 400 nm à l’aide d’un spectropolarimètre à 25 °C. Les paramètres et les conditions de cette mesure ont été décrits précédemment²⁹. Les résultats se trouvent à la figure supplémentaire 1.
   REMARQUE : Assurez-vous d’enregistrer le spectre du CD pour que la mémoire tampon seule agisse comme un blanc.

2. Préparation des matrices d’ADN

REMARQUE : Les modèles pouvant être répliqués sont de courts modèles linéaires amorcés de 100 nt préparés à l’aide de techniques de biologie moléculaire standard. Le gabarit de formation G4 (5′-GAATTACATTTAAATTTTACACAGATACAGTCAATGAGAA
CTTCCAGGCGTAACGAGAGCACGGGGTGGGGGGG
GGGACCTTAGCTTCGAGTTCCGAT-3') contient la séquence capable de former un G-quadruplex dérivé de MYC (à partir de l’étape 1) en son centre. Le gabarit de contrôle (5'-GAATTACATTTAAATTTTACACAGATACAGTCAATGAGA
ACTTCCAGGCGTAACGAGAGCACGATGTAGCAGAACT
GTGACCTTAGCTTCGAGTTCCGAT-3') a la même région de contrôle (de l’étape 1) également en son centre.

1. Pour recuire l’amorce sur les matrices d’ADN formant G4 et de contrôle, mélangez 20 μM de l’amorce (5′-Biotine-AF647-TCTTAATGTAAATTTAAAATGTGTC-3′) à 20 μM des matrices de 100 nt dans le tampon TE complété par 200 mM de KCl.
2. Chauffer les solutions de matrice d’ADN à 95 °C dans un bain sec numérique pendant 15 min. Une fois terminé, refroidissez lentement les solutions pendant la nuit en plaçant le bloc chauffant dans du polystyrène pour permettre le pliage du G4 et le recuit des deux brins.

3. Marquage de l’ADN polymérase avec AF647

1. Marquage de la polymérase avec le colorant
   REMARQUE : La levure Pol δ a été exprimée et purifiée comme décrit précédemment³⁰. La polymérase a ensuite dû être marquée avec le colorant monoréactif ester NHS Alexa Fluor (AF647) pour permettre la visualisation au niveau de la molécule unique. Cette opération s’est déroulée^{comme décrit} précédemment5.
   1. Pour marquer l’extrémité N-terminale, incubez un excès 3 fois plus important du colorant AF647 avec 320 μL de δ Pol 58,5 μM dans un tampon contenant 30 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 2 mM de dithiothréitol (DTT), 300 mM de chlorure de sodium (NaCl), 50 mM de glutamate de potassium et 10 % (v/v) de glycérol pendant 10 min à 4 °C. Faites pivoter doucement la solution pour assurer un mélange complet et améliorer l’efficacité de l’étiquetage.
      REMARQUE : La séquence protéique peut contenir des amines primaires supplémentaires dans les acides aminés lysine. En ajustant les conditions de réaction, telles que le pH, l’étiquette peut être attachée de préférence à l’extrémité N-terminale plutôt qu’aux résidus de lysine. Cela peut nécessiter une optimisation supplémentaire pour augmenter l’efficacité de l’étiquetage.
   2. Pour préparer les colonnes de dessalage par centrifugation de 0,5 mL (poids moléculaire coupé de 7 K), centrifugez d’abord les colonnes à 1500 x g pendant 1 min pour éliminer la solution de stockage. Jetez les solutions déposées dans le tube de collecte après la centrifugation.
      REMARQUE : Assurez-vous de desserrer le capuchon des colonnes de centrifugation pendant les étapes de centrifugation. Cela garantira que les colonnes sont correctement éluées.
   3. Équilibrez les colonnes dans un tampon contenant 30 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 300 mM de NaCl, 3 mM de DTT, 50 mM de glutamate de potassium et 5 % (v/v) de glycérol en ajoutant 300 μL de tampon au sommet de la colonne. Centrifuger la colonne à 1500 x g pendant 1 min et jeter le flux. Répétez ce processus deux fois de plus.
   4. Appliquez 200 μL de chaque échantillon de δ Pol sur la colonne. Centrifugez les colonnes à 1500 x g pendant 2 min et recueillez le δ de Pol purifié dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml.
   5. Congelez les fractions purifiées dans du liquide_N2 et stockez les aliquotes à -80 °C pour éviter la dégradation des protéines dans le temps.
2. Déterminer l’efficacité de l’étiquetage
   1. Chargez 2 μL de l’échantillon de Pol δ maintenant marqué AF647 sur un spectrophotomètre UV-vis³¹.
      REMARQUE : Assurez-vous d’abord qu’une pièce vierge de la mémoire tampon δ Pol est mesurée.
   2. Mesurez les longueurs d’onde d’excitation de 650 nm pour le colorant AF647 et de 280 nm pour le δ Pol à l’aide du spectrophotomètre.
   3. À l’aide de la loi de Beer-Lambert et des coefficients d’extinction molaire de 270 000 ^{cm-1 M-1} pour le colorant AF647 et de 195 960 ^{cm-1 M-1} pour la polymérase, calculez l’efficacité de l’étiquetage.
      REMARQUE : L’efficacité de marquage déterminée pour la levure Pol marquée AF647 δ utilisée dans ce test a été calculée à environ 67 %.

4. Test d’extension de l’amorce d’ensemble

REMARQUE : Avant d’effectuer des expériences de réplication d’une molécule unique, il est nécessaire de confirmer que l’ADN polymérase est bloquée par le G-quadruplex via des tests de réplication en vrac.

1. Réglez la température d’un bloc chauffant dans un bain sec numérique à 30 °C. Cela garantira l’activité maximale de la levure Pol δ.
2. Préparer des « mélanges maîtres » pour les matrices formatrices et témoins de G4 dans le tampon de réplication (25 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM d’acétate de magnésium, 50 mM de glutamate de potassium, 40 μg/mL d’albumine sérique bovine (BSA), 0,1 mM d’EDTA, 5 mM de DTT et 0,0025 % (v/v) de Tween-20). Complétez chaque mélange avec 1 mM de DTT, 250 μM de dTTP, dCTP, dATP, dGTP (dNTP) et 10 nM de la matrice d’ADN respective (formation de G4 ou contrôle). Placez-les dans un bloc chauffant pour qu’ils atteignent 30 °C.
3. Tremper 12 μL de chaque mélange maître avec 12 μL de tampon de charge de formamide (80 % (p/v) de formamide, 10 mM d’EDTA) pour agir comme témoin T = 0 min.
4. Pour initier la synthèse de l’ADN, ajoutez de la levure Pol δ marquée AF647 à chaque mélange maître (concentration finale de 20 nM). Mélangez soigneusement pour vous assurer que les ADN polymérases reproduisent les matrices avec une efficacité maximale.
   REMARQUE : Gardez la levure Pol δ sur de la glace pendant l’utilisation pour préserver l’activité enzymatique.
5. Après 30 s, 60 s et 180 s, prélever 12 μL de chaque mélange principal et tremper avec 12 μL de tampon de charge de formamide. Le rapport 1:1 entre le mélange principal et le tampon de chargement du formamide garantit que la réaction de réplication ne peut pas se poursuivre une fois trempée.
6. Retirez les solutions maintenant trempées du bloc chauffant à 30 °C et placez-les dans un bloc chauffant à 98 °C à la place pour dénaturer l’ADNdb en ADNsb. Une fois que 10 minutes se sont écoulées, amenez l’ensemble du bloc chauffant dans le réservoir de gel pour le chargement des solutions dans un gel dénaturant à 15 % de tris-borate-EDTA (TBE)-urée polyacrylamide (PAGE) gel³².
   REMARQUE : Le gel PAGE doit être chauffé avant le chargement des échantillons en exécutant l’électrophorèse sur gel à 180 V pendant 30 min dans 1x tampon TBE. Une fois terminé, rincez chaque puits pour éliminer l’urée.
7. Chargez 15 μL de chaque échantillon sur le gel à côté d’une échelle contenant 0,02 μM d’oligonucléotides marqués à 20 nt, 60 nt et 100 nt dans un tampon de chargement de formamide.
8. Faites fonctionner le gel pendant 60 min à 180 V dans 1x tampon TBE pour assurer une séparation complète.
9. Imagez le gel dans le canal Cy5 d’un imageur biomoléculaire. Cela permettra de mesurer le brin d’ADN répliqué contenant le marqueur AF-647.

5. Microscopie à fluorescence à molécule unique

1. Fonctionnalisation des lamelles
   REMARQUE : Pour fixer les matrices d’ADN à la lamelle de verre, celle-ci doit d’abord être fonctionnalisée avec de l’aminosilane, puis attachée à des molécules de PEG biotinylées. Ce processus minimise les interactions non spécifiques entre l’ADN et/ou les protéines et la surface.
   1. Nettoyez les lamelles (24 x 24 mm) en les insérant dans des bocaux de coloration et en versant de l’éthanol. Sonicez les bocaux pendant 30 min avant de rincer les lamelles à l’eau pure. Répétez ce processus avec 1 M d’hydroxyde de potassium (KOH) avant de rincer à nouveau. Répétez ces étapes de nettoyage une fois de plus.
   2. Rincez et remplissez un nouveau pot d’acétone et placez les lamelles à l’intérieur. Disséminer le 3-aminopropyltriéthoxysilane dans le bocal pour former une solution à 2 % v/v. Agitez le bocal pendant 3 min avant d’éteindre la réaction avec un grand excès d’eau.
   3. Séchez les lamelles avec du N₂ et placez-les individuellement sur une boîte humide remplie d’eau. Cela empêchera les lamelles de se dessécher.
   4. Préparez un ester Biotine-PEG-SVA :mPEG-SVA 1:25 dans 100 mM de NaHCO₃ (pH 8,2). Agitez ce mélange pendant 20 s pour assurer un mélange complet.
   5. Pipeter 40 μL de la solution PEG sur une lamelle sèche. Placez une autre lamelle sur le dessus pour « prendre en sandwich » la solution entre les deux lamelles. Cela permettra de fonctionnaliser les faces de la lamelle à l’intérieur. Répétez l’opération pour tous les bordereaux de protection.
   6. Incuber les lamelles dans l’obscurité pendant 3 h. Après l’incubation, séparez les paires de lamelles, rincez-les avec l’excès d’eau et séchez-les avec du gaz_N2 comprimé.
   7. Répétez les étapes 4.1.4 à 4.1.5 pour appliquer une deuxième couche de PEG sur les lamelles. Assurez-vous de prendre en sandwich les côtés précédemment fonctionnalisés ensemble, alors veillez à ne pas les retourner accidentellement pendant les étapes de lavage. Incuber les solutions dans l’obscurité pendant la nuit avant de les rincer et de les sécher.
   8. Rangez les lamelles dans le vide pour préserver leur fonctionnalité. Les lamelles fonctionnalisées sont stables pendant un mois lorsqu’elles sont stockées correctement.
2. Préparation de cellules d’écoulement microfluidique
   REMARQUE : Une cellule d’écoulement microfluidique³³ est construite pour des expériences sur une seule molécule (voir la figure supplémentaire 2). Cela permettra aux tampons, aux matrices d’ADN et aux protéines d’entrer en contact avec une lamelle fonctionnalisée (voir étape 5.1).
   1. Retirez une lamelle fonctionnalisée d’un aspirateur et placez-la sur un support à microtubes partiellement rempli d’eau (boîte humide). Mélanger 100 μL d’un tampon bloquant (50 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 50 mM de KCl, 2 % (v/v) Tween-20) avec 25 μL de solution de neutravidine à 1 mg/mL (10 % de PBS) et étaler le tout sur la surface de la lamelle. Laissez incuber pendant 15 min à température ambiante dans la boîte humide.
   2. Lavez la lamelle à l’eau et séchez-la en N₂. N’oubliez pas qu’un seul côté de la lamelle est fonctionnalisé, alors rappelez-vous de quel côté il s’agit.
   3. Placez le bloc³⁴ de polydiméthylsiloxane (PDMS) sur mesure sur la lamelle à l’intérieur du support de cellule d’écoulement. Cela générera un canal d’écoulement de 100 μm de haut et 1 mm de large. Des tubes en polyéthylène (PE-60 : 0,76 mm de diamètre d’entrée et 1,22 mm de diamètre extérieur) peuvent ensuite être insérés dans les trous de la cellule d’écoulement pour permettre l’accès aux tampons et aux substrats.
3. Imagerie par fluorescence d’une seule molécule
   REMARQUE : Ces expériences doivent être effectuées à l’aide des gabarits de formage G4 et de contrôle. Cela permettra de visualiser les deux conditions (blocage de la δ Pol par une structure G4 et aucun blocage) au niveau de la molécule unique à l’aide de la microscopie à réflexion interne totale (TIRF).
   1. Chauffer 1 mL d’aliquotes d’un tampon de blocage Tween (50 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 50 mM de KCl, 2 % (v/v) de Tween-20) et 500 μL d’aliquotes d’un tampon de lavage (25 mM de Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM d’acétate de magnésium, 250 mM de glutamate de potassium, 40 μg/mL de BSA, 0,1 mM d’EDTA, 5 mM de DTT, 0,0025 % (v/v) Tween-20) et la mémoire tampon de réplication à 40 °C pendant 15 min. Cela libérera les gaz des solutions. Dégazez les solutions dans une chambre à vide pendant 15 minutes supplémentaires à 800 mbar en dessous de la pression atmosphérique.
   2. Prenez la cellule d’écoulement construite (voir étape 4.2) et placez-la sur la platine du microscope. Après avoir placé une goutte d’huile sur l’objectif, soulevez l’objectif pour rencontrer la lamelle.
      REMARQUE : Assurez-vous que l’objectif et la cellule d’écoulement ont le temps d’atteindre 31 °C. Cela augmentera l’activité de la levure Pol δ et contribuera à garantir des données reproductibles.
   3. Insérez le tube d’entrée dans le tampon de blocage Tween dégazé et connectez la sortie à la pompe à seringue. Tirez sur la seringue pour aspirer le tampon de blocage Tween à travers le tube dans le canal. Laissez ce tampon incuber pendant au moins 30 minutes pour minimiser les interactions non spécifiques.
   4. Verser dans le canal un tampon de lavage dégazé de 200 μL à un débit de 100 μL/min. Cela videra la mémoire tampon de blocage de l’interpolation.
   5. Diluez les solutions de matrice d’ADN à 0,5 pM dans un tampon de réplication de 500 μL. Débit de 150 μL dans le canal à un débit de 10 μL/min. Illuminez l’échantillon à l’aide d’un laser de 647 nm à environ 900 ^mWcm-2 dans le plan de l’échantillon pour visualiser les modèles d’ADN individuels.
      REMARQUE : Si le champ de vision (FOV) de l’échantillon n’est pas complètement net, il se peut que la lamelle ne soit pas alignée contre le fond de la cellule d’écoulement construite. Construisez une nouvelle cellule d’écoulement à l’aide d’une nouvelle lamelle si cela se produit.
   6. Une fois qu’une densité suffisante de taches (environ 1 point pour 10 μm²) est visible, versez une nouvelle solution de tampon de réplication (complétée par 1 mM de DTT) dans le canal pour éliminer l’excès d’ADN. Un volume de 250 μL est suffisant pour éliminer complètement tout l’ADN non lié.
   7. Passez à un nouveau FOV et capturez une image de l’ADN pour déterminer le degré de colocalisation entre la polymérase marquée et le substrat de l’ADN. Une fois terminé, augmentez la puissance du laser pour photoblanchir les taches restantes.
   8. Préparez une solution de polymérase contenant 1 mM de DTT, 250 μM de dNTP et 20 nM de δ Pol marqués AF647 dans 200 μL de tampon de réplication. Verser 100 μL de la solution de polymérase à un débit de 5 μL/min dans le canal.
   9. Une fois que l’échantillon est mis au point et que l’angle TIRF a été ajusté, réglez la puissance laser d’un laser de 647 nm à environ 900 ^mWcm-2 dans le plan de l’échantillon. Ensuite, commencez à imager le champ de vision pendant la durée souhaitée. Acquérez entre 1 et 5 images/s pendant 10 à 20 minutes pour capturer tous les événements de réplication.
4. Analyse des données
   REMARQUE : Toutes les analyses ont été effectuées à l’aide de Python (v. 3.11.7). Le code personnalisé utilisé pour l’analyse des données est disponible ici : https://github.com/Single-molecule-Biophysics-UOW/G-quadruplex_binding_analysis.
   1. Tout d’abord, colocalisez les taches de matrice d’ADN avec les taches fluorescentes de la levure Pol δ marquée. Il a été déterminé que deux pics étaient colocalisés si leur distance après correction de la dérive était ≤ 3 pixels. Seules les taches de δ Pol qui colocalisent les matrices d’ADN sont analysées pour leur cinétique de liaison et leurs tendances comportementales globales.
   2. Pour déterminer les données d’événement liées, mesurez l’intensité dans le temps de chaque point lorsqu’il présente un comportement « on/off » tout au long du film. Cela permet de déterminer combien de fois la liaison au δ Pol se produit sur une seule matrice d’ADN.
      REMARQUE : Cette analyse est effectuée à la fois pour les expériences de formation de G4 et de modèle de contrôle afin de comparer la dynamique de liaison.
      REMARQUE : Des expériences de contrôle ont été réalisées, qui garantissent que les événements de liaison non spécifiques au G-quadruplex ou au modèle lui-même (23,2 s ± 4,9 s) ne sont pas inclus dans l’analyse des événements de liaison.

Pour ce test, deux substrats d’ADN avec une amorce de 20 nt marquée par fluorescence ont été conçus : l’un contenant une séquence formant G4 (figure 1A, à gauche) et l’autre dépourvu de cette séquence (figure 1A, à droite). Pour confirmer que le G-quadruplex est un obstacle efficace à l’activité de la polymérase, la synthèse de l’ADN par Pol δ a été suivie sur un gel PAGE dénaturant. L’activité du δ Pol marqué purifié sur les substrats d’ADN a été examinée par électrophorèse sur gel. La figure 1B (à gauche) montre que le δ Pol marqué par fluorescence est incapable de synthétiser au-delà du G-quadruplex. Avant le début de la synthèse (t = 0 min), une bande correspondant à 20 nt est présente, représentant l’amorce marquée qui a été dénaturée du brin matrice. Après 3 min, cette bande de 20 nt a été convertie en une bande de 60 nt, indiquant que la synthèse a eu lieu sur tout l’ADN et confirmant que la polymérase était complètement bloquée par la structure G-quadruplex. Ce blocage implique que la polymérase ne peut ni se déplier ni contourner la structure. En revanche, la synthèse d’un modèle de contrôle qui ne contient pas la séquence formant G-quadruplex (figure 1A, à droite) a produit une bande de 100 nt après 3 minutes (figure 1B, à droite).

Après confirmation de la synthèse sur les matrices et du blocage efficace par le G-quadruplex, ces mesures ont été répétées sur un microscope à fluorescence à molécule unique pour surveiller le comportement de la polymérase. Les matrices d’ADN ont été attachées à des lamelles fonctionnalisées (Figure 2A) dans une cellule d’écoulement microfluidique, et la position de chaque substrat a été déterminée en visualisant l’amorce marquée par fluorescence. Ensuite, le Pol δ marqué a été chargé en présence de dNTP pour lancer la synthèse. Dans un champ de vision typique, les taches individuelles sont suivies pour quantifier la fréquence à laquelle Pol δ se lie et se dissocie de l’ADN (figures 2B et C). En mesurant l’intensité en fonction du temps au niveau de chaque substrat d’ADN, il est possible de générer des trajectoires de molécules uniques (Figure 2C, Figure supplémentaire 3). Le « temps d’attente » caractéristique, c’est-à-dire la durée moyenne pendant laquelle Pol δ reste lié au modèle, peut être mesuré. Pour le substrat G4, le temps de séjour a été déterminé à 6 s ± 2 s, tandis que pour le substrat témoin, il était de 10 s ± 3 s (figure 2D, figure supplémentaire 4). De plus, pour chaque trajectoire, le nombre de fois où Pol δ se lie au modèle peut être quantifié. Le nombre d’événements de liaison au substrat G4 est beaucoup plus élevé par rapport au modèle de contrôle (Figure 2E). Bien qu’il y ait des cas de plus d’un événement de liaison dans le modèle de contrôle en raison de la liaison et de la désintégration scolaires, il y a une nette augmentation du nombre d’événements de liaison en moyenne pour le modèle de formation G4. Cela suggère que, après l’arrêt de la synthèse par le G-quadruplex, la polymérase liée se dissocie de l’ADN avant que les nouvelles polymérases de la solution n’engagent un cycle continu de liaison et de déliaison. Par conséquent, ce test à molécule unique fournit des informations inégalées sur la façon dont les ADN polymérases réagissent aux obstacles de l’ADN.

Figure 1 : Essai d’extension de l’amorce d’ensemble. (A) Représentation schématique des substrats d’ADN. Le substrat G4 (à gauche) contient une séquence formant le G-quadruplex, alors que le substrat témoin (à droite) n’en contient pas. (B) Essai d’extension de la primase de l’ADN G4 amorcé et des substrats d’ADN témoin montrant que la levure Pol δ marquée par fluorescence est entièrement bloquée par le G-quadruplex. Le gel PAGE montre la réplication des matrices d’ADN au fil du temps, ce qui entraîne un décalage de l’amorce de 20 nt marquée dans le produit de 60 nt pour le substrat G4 (à gauche) et le produit de 100 nt pour le modèle de contrôle (à droite). M représente une échelle contenant des oligos étiquetés de 20 nt, 60 nt et 100 nt. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Microscopie à fluorescence à molécule unique. (A) Représentation schématique du test d’extension d’amorce à molécule unique à l’aide de la levure Pol δ marquée AF647. (B) Champ de vision typique obtenu à partir d’un test à molécule unique. Chaque tache représente un δ Pol marqué par fluorescence qui se lie à un modèle d’ADN. Barre d’échelle : 10 μm. (C) (En haut) Exemple de molécule du test à molécule unique montrant la liaison on/off lors des échanges de δ Pol. (En bas) Trajectoire d’une seule molécule de la même molécule montrant l’intensité au cours de l’expérience. La ligne noire représente le modèle de Markov caché (HMM) ajusté aux données. (D) Temps de séjour de Pol δ sur le substrat G4 (violet) et le substrat témoin (gris). Les lignes représentent des ajustements exponentiels, donnant une durée de vie de 6 s ± 2 s sur le substrat G4 et de 10 s ± 3 s sur le substrat de contrôle. (E) Nombre d’événements de liaison de Pol δ à des substrats d’ADN uniques. Le nombre médian d’événements de liaison sur le substrat G4 (violet) est de 3,5, par rapport au substrat témoin 1 (gris). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : spectroscopie CD. Spectres CD de la séquence formant G4 (violet) et de la séquence témoin (gris) dans un tampon TE contenant 200 mM de KCl à 25 °C. Le pic caractéristique à 260 nm, suivi du pic négatif à 240 nm, est caractéristique d’un GQ parallèle intramoléculaire. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Construction de la cellule d’écoulement. (A) Schéma des différentes pièces de la cellule d’écoulement. Le bloc PDMS carré se trouve au-dessus de la lamelle du microscope. Ces pièces sont ensuite assemblées à l’intérieur du couvercle et du fond du support de cellule d’écoulement. (B) La cellule d’écoulement complète. Des tubes peuvent être insérés de chaque côté du bloc PDMS pour former les canaux à travers lesquels les tampons peuvent être écoulés à travers le dispositif via la microfluidique. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 3 : Trajectoires d’une seule molécule. (A) Exemple de trajectoire d’une molécule subissant un seul événement de liaison pendant les 10 minutes de l’expérience. (B) Exemple de trajectoire d’une molécule subissant des événements de liaison zéro pendant les 10 minutes de l’expérience. La ligne noire dans (A) et (B) représente l’ajustement du modèle de Markov caché (HMM) aux données. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 4 : Temps de séjour. (A) Temps de séjour de la δ Pol sur le substrat G4. La ligne représente l’ajustement exponentiel, ce qui donne une durée de vie de 6 s ± 2 s. (B) Temps de séjour de Pol δ sur le substrat de contrôle. L’ajustement exponentiel donne une durée de vie de 10 s ± 3 s. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 5 : Contrôle du photoblanchiment. Le graphique montre le temps moyen nécessaire pour qu’une enzyme Pol δ de levure marquée AF647 soit photoblanchie par le laser de 647 nm. La ligne représente l’ajustement exponentiel, ce qui donne une durée de vie de 39 ± 6 s. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Ici, un test basé sur la fluorescence d’une molécule unique a été décrit qui donne un aperçu du comportement d’une ADN polymérase lorsqu’elle rencontre un G-quadruplex. Alors que les protocoles de génération de matrices d’ADN, de marquage δ Pol et de réplication de l’ADN en vrac sont tous simples, l’exécution de tests de microscopie à molécule unique est plus difficile sur le plan technique. En raison de la nature des techniques à molécule unique, il faut prendre grand soin d’éviter l’introduction de poussière, de contamination ou de bulles d’air, car ceux-ci obscurcissent le champ de vision et entravent la collecte de données.

L’une des limites des expériences de microscopie TIRF à molécule unique est le photoblanchiment des fluorophores qui sont couplés de manière covalente aux biomolécules d’intérêt. Le photoblanchiment est un processus irréversible conduisant à une perte de fluorescence permanente³⁵. Pour atténuer cela pendant les expériences, il est essentiel de limiter la durée d’exposition au laser, d’ajuster l’intensité du laser et d’optimiser le timing de l’imagerie. Ces stratégies permettent de préserver les signaux de fluorescence, assurant des périodes d’observation plus fiables et plus longues. En ajustant finement ces paramètres, le signal Pol δ reste pendant toute la durée de la mesure. Afin d’optimiser la puissance du laser pour les tests de synthèse par microscopie à fluorescence monomoléculaire, il est conseillé de mesurer le taux de photoblanchiment en imageant la polymérase marquée sur une lamelle en verre propre. En faisant varier systématiquement la puissance du laser et en évaluant le taux de photoblanchiment dans le champ de vision, on peut identifier l’intensité laser optimale qui équilibre l’intensité du signal fluorophore avec la résistance au photoblanchiment (voir la figure supplémentaire 5).

Le principal avantage de cette approche à molécule unique par rapport aux méthodes traditionnelles basées sur des ensembles est sa capacité à visualiser directement quand une ADN polymérase individuelle rencontre et interagit avec une structure G4. Les méthodes traditionnelles basées sur l’ensemble (telles que l’électrophorèse sur gel) ont démontré la capacité des structures G4 à bloquer les ADN polymérases 23,36,37. Cependant, ces techniques ne parviennent pas à fournir les informations cinétiques et mécanistiques en temps réel de cette interaction, qui sont nécessaires pour démêler les différentes étapes et résultats cinétiques moléculaires. Les techniques à molécule unique offrent un aperçu inégalé de la cinétique, des mécanismes et des comportements des biomolécules souvent cachées par une moyenne d’ensemble³⁸. Il est maintenant possible de voir comment les ADN polymérases agissent en temps réel - qu’elles échangent, calent, dissocient ou contournent les barrages routiers de l’ADN³⁹. Une fois ce protocole établi, l’identité du G4 peut facilement être modifiée de la structure parallèle c-MYC choisie à n’importe quelle topologie parallèle, anti-parallèle ou hybride. L’application de ce test sur une seule molécule révélera si les mêmes ADN polymérases se comportent différemment lorsqu’elles rencontrent des topologies G4 alternatives. En tant que telles, les méthodes à molécule unique sont essentielles pour répondre à des questions spécifiques concernant la façon dont les protéines et l’ADN du corps interagissent.

Grâce à la visualisation directe des interactions de l’ADN polymérase avec les G-quadruplexes, une voie d’échange jusque-là non caractérisée pour la δ Pol de levure a été identifiée. Cette découverte suggère que la polymérase se désengage lorsqu’elle rencontre un G-quadruplex, attendant l’intervention d’une autre protéine pour résoudre la structure avant de relancer la synthèse de l’ADN. Ce protocole peut être adapté pour étudier les interactions entre diverses protéines de maintenance du génome et les obstacles de l’ADN, offrant ainsi des informations inégalées sur la façon dont les enzymes cellulaires naviguent dans les obstacles génomiques. Par exemple, l’obstacle de ce test peut être modifié d’une structure G4 à une réticulation protéine-ADN, un type de lésion de l’ADN dans laquelle une protéine est liée de manière covalente irréversible à l’ADN, agissant comme un obstacle à la réplication de l’ADN⁴⁰. De tels examens sont cruciaux pour comprendre les processus fondamentaux de la réplication, de la réparation et de la recombinaison de l’ADN. En permettant l’étude de la dynamique ADN-protéines au niveau moléculaire, ce test fournit un outil puissant pour élucider les mécanismes sous-jacents à l’intégrité génomique.

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

N.K.-A. reconnaît le financement accordé par la bourse du programme de formation en recherche du gouvernement australien. L.M.S. est reconnaissante du financement qu’elle a reçu du Conseil national de la santé et de la recherche médicale (bourse de chercheur 2007778). J.S.L est reconnaissant d’être le récipiendaire d’un prix Discovery Early Career Award (DE240100780) et d’un NHMRC Investigator EL1 (2025412) financés par le gouvernement australien. S.H.M est reconnaissant d’être le récipiendaire de la bourse de carrière Bruce Warren Molecular Horizons Ealy.