À Silico Identification et caractérisation des ARNcirc au cours des interactions hôte-pathogène

Le protocole soumis ici explique le pipeline in silico complet nécessaire pour prédire et caractériser fonctionnellement les circRNA à partir de données de transcriptome de séquençage de l’ARN étudiant les interactions hôte-pathogène.

Les ARN circulaires (circRNA) sont une classe d’ARN non codants qui sont formés par épissage arrière. Ces circRNA sont principalement étudiés pour leurs rôles de régulateurs de divers processus biologiques. Notamment, de nouvelles preuves démontrent que les circRNA de l’hôte peuvent être exprimés de manière différentielle (DE) lors de l’infection par des agents pathogènes (p. ex. grippe et coronavirus), ce qui suggère un rôle pour les ARNcirc dans la régulation des réponses immunitaires innées de l’hôte. Cependant, les recherches sur le rôle des circRNA lors d’infections pathogènes sont limitées par les connaissances et les compétences requises pour effectuer l’analyse bioinformatique nécessaire pour identifier les circRNA DE à partir des données de séquençage de l’ARN (RNA-seq). La prédiction bioinformatique et l’identification des circRNA sont cruciales avant toute vérification et études fonctionnelles utilisant des techniques de laboratoire humide coûteuses et longues. Pour résoudre ce problème, un protocole étape par étape de prédiction et de caractérisation in silico des circRNA à l’aide de données RNA-seq est fourni dans ce manuscrit. Le protocole peut être divisé en quatre étapes : 1) Prédiction et quantification des circRNA DE via le pipeline CIRIquant ; 2) Annotation via circBase et caractérisation des circRNAs DE; 3) Prédiction de l’interaction CircRNA-miARN par pipeline Circr; 4) analyse de l’enrichissement fonctionnel des gènes parentaux circRNA à l’aide de l’ontologie génique (GO) et de l’Encyclopédie des gènes et des génomes de Kyoto (KEGG). Ce pipeline sera utile pour mener de futures recherches in vitro et in vivo afin de mieux comprendre le rôle des circRNA dans les interactions hôte-pathogène.

Les interactions hôte-pathogène représentent une interaction complexe entre les agents pathogènes et les organismes hôtes, qui déclenche les réponses immunitaires innées des hôtes qui finissent par entraîner l’élimination des agents pathogènes envahisseurs ^1,2. Au cours des infections pathogènes, une multitude de gènes immunitaires de l’hôte sont régulés pour inhiber la réplication et la libération d’agents pathogènes. Par exemple, les gènes communs stimulés par l’interféron (ISG) régulés sur les infections pathogènes comprennent ADAR1, IFIT1, IFIT2, IFIT3, ISG20, RIG-I et OASL ^3,4. Outre les gènes codant pour les protéines, des études ont également rapporté que les ARN non codants tels que les longs ARN non codants (ARNnc), les microARN (miARN) et les ARN circulaires (ARNcirc) jouent également un rôle et sont régulés simultanément lors d’infections pathogènes ^5,6,7. Contrairement aux gènes codant pour des protéines qui codent principalement des protéines en tant que molécules fonctionnelles, les ARN non codants (ARNnc) sont connus pour fonctionner comme régulateurs des gènes aux niveaux transcriptionnel et post-transcriptionnel. Cependant, les études impliquant la participation d’ARN non codants, en particulier les circRNA, dans la régulation des gènes immunitaires des hôtes ne sont pas bien rapportées par rapport aux gènes codant pour les protéines.

Les circRNA sont largement caractérisés par leur structure de boucle continue fermée par covalence, qui est générée par un processus d’épissage non canonique appelé back-sprisage⁸. Le processus d’épissage arrière, contrairement au processus d’épissage des ARN linéaires apparentés, implique la ligature du site donneur en aval vers le site accepteur en amont, formant une structure de forme circulaire. Actuellement, trois mécanismes différents d’épissage inverse pour la biogenèse des circRNAs ont été proposés. Il s’agit de la circularisation médiée par la protéine de liaison à l’ARN⁽RBP) 9,10, de la circularisation induite par l’appariement d’introns 11 et de la circularisation induite par le lariat^12,13,14. Étant donné que les circRNA sont connectés bout à bout dans une structure circulaire, ils ont tendance à être naturellement résistants aux digestions normales des exonucléases et, par conséquent, sont considérés comme plus stables que leurs homologues linéaires¹⁵. Une autre caractéristique commune présentée par les circRNA comprend l’expression spécifique au type de cellule ou de tissu chez les hôtes¹⁶.

Comme l’impliquent leur structure unique et leur expression spécifique à la cellule ou au tissu, on a découvert que les circRNA jouent des fonctions biologiques importantes dans les cellules. À ce jour, l’une des fonctions importantes des circRNA est leur rôle en tant qu’éponges de microARN (miARN)^17,18. Ce rôle régulateur des circRNA se produit par la liaison complémentaire des nucléotides circRNA avec la région semencière des miARN. Une telle interaction circRNA-miARN inhibe les fonctions régulatrices normales des miARN sur les ARNm cibles, régulant ainsi l’expression des gènes^19,20. De plus, les circRNA sont également connus pour réguler l’expression des gènes en interagissant avec les protéines de liaison à l’ARN (RBP) et en formant des complexes ARN-protéine²¹. Bien que les circRNA soient classés comme ARN non codants, il existe également des preuves que les circRNA peuvent servir de modèles pour la traduction des protéines^22,23,24.

Récemment, il a été démontré que les circRNA jouent un rôle central dans la régulation des interactions hôte-pathogène, en particulier entre les hôtes et les virus. En général, les circRNA de l’hôte sont supposés aider à réguler les réponses immunitaires de l’hôte pour éliminer les agents pathogènes envahisseurs. Un exemple de circRNA qui favorise les réponses immunitaires de l’hôte est circRNA_0082633, rapporté par Guo et ^al.25. Ce circRNA améliore la signalisation de l’interféron de type I (IFN) dans les cellules A549, ce qui aide à supprimer la réplication du virus de la grippe²⁵. De plus, Qu et al. ont également signalé un circRNA intronique humain, appelé circRNA AIVR, qui favorise l’immunité en régulant l’expression de la protéine de liaison CREB (CREBBP), un transducteur de signal de l’IFN-β^26,27. Cependant, il existe également des circRNA connus pour favoriser la pathogenèse de la maladie lors de l’infection. Par exemple, Yu et al. ont récemment rapporté le rôle joué par un circRNA épissé à partir du domaine du doigt de zinc GATA contenant le gène 2A (circGATAD2A) dans la promotion de la réplication du virus H1N1 par l’inhibition de l’autophagie de la cellule hôte²⁸.

Pour étudier efficacement les circRNA, un algorithme de prédiction circRNA à l’échelle du génome est généralement mis en œuvre, suivi d’une caractérisation in silico des candidats circRNA prédits avant que toute étude fonctionnelle puisse être réalisée. Une telle approche bioinformatique pour prédire et caractériser les circRNA est moins coûteuse et plus rapide. Il aide à affiner le nombre de candidats à étudier fonctionnellement et pourrait potentiellement conduire à de nouvelles découvertes. Ici, nous fournissons un protocole bioinformatique détaillé pour l’identification in silico , la caractérisation et l’annotation fonctionnelle des circRNA au cours des interactions hôte-pathogène. Le protocole comprend l’identification et la quantification des circRNA à partir d’ensembles de données de séquençage d’ARN, l’annotation via circBase et la caractérisation des candidats circRNA en termes de types circRNA, de nombre de gènes qui se chevauchent et d’interactions circRNA-miARN prévues. Cette étude fournit également l’annotation fonctionnelle des gènes parentaux circRNA par le biais de l’ontologie génique (GO) et de l’analyse d’enrichissement de l’Encyclopédie des gènes et des génomes de Kyoto (KEGG).

Dans ce protocole, des ensembles de données de bibliothèque de séquençage d’ARN ribosomique (ARNr) appauvris en ARN dépersonnalisés, préparés à partir de cellules de macrophages humains infectées par le virus de la grippe A, ont été téléchargés et utilisés à partir de la base de données GEO (Gene Expression Omnibus). L’ensemble du pipeline bioinformatique, de la prédiction à la caractérisation fonctionnelle des circRNA, est résumé à la figure 1. Chaque partie du pipeline est expliquée plus en détail dans les sections ci-dessous.

1. Préparation, téléchargement et configuration avant l’analyse des données

NOTE: Tous les progiciels utilisés dans cette étude sont gratuits et open-source.

1. Téléchargement des outils requis sur la plateforme Linux
   1. Téléchargez et installez les logiciels et outils requis répertoriés dans le tableau des matériaux sur un ordinateur Linux haute performance en suivant les instructions fournies par le développeur.
      REMARQUE: La plupart des outils et logiciels ont leurs propres pages GitHub en ligne ou une documentation contenant des instructions sur l’installation et l’utilisation de leurs outils (reportez-vous au tableau des matériaux).
   2. Téléchargez les ensembles de données de séquençage d’ARN souhaités pour la détection et l’analyse de circRNA à partir de sites Web d’archives de séquences (par exemple, European Nucleotides Archive et Gene Expression Omnibus).
   3. Téléchargez le(s) génome(s) de référence (format FASTA) et les fichiers d’annotation (format GTF/GFF3), compatibles avec l’hôte à partir duquel l’ensemble de données RNA-seq a été préparé. Les génomes de référence de l’hôte et les fichiers d’annotation se trouvent généralement sur les navigateurs de génomes en ligne tels que le National Center for Biotechnology Information (NCBI), l’Université de Californie à Santa Cruz (UCSC) et les sites Web Ensembl.
2. Contrôle de la qualité du séquençage de l’ARN
   1. Entrez les fichiers FASTQ dans le programme FASTQC pour déterminer la qualité des séquences d’ARN. Si la qualité des fichiers FASTQ est faible (par exemple, 29,30.

2. Prédiction et analyse d’expression différentielle des circRNA à l’aide de CIRIquant

REMARQUE : Un manuel plus détaillé sur l’installation et l’exécution de l’analyse d’expression différentielle se trouve dans la section disponibilité du code du document CIRIquant³¹. Les données supplémentaires incluent également certaines des commandes de base utilisées dans ce protocole.

1. Prédictions CircRNA
   1. Indexez d’abord le génome de référence de l’hôte à l’aide des aligneurs BWA et HISAT2. Ensuite, sur un terminal Linux, exécutez les commandes bwa index 32 et hisat2-build³³ dans le répertoire du génome de référence de l’hôte pour l’indexer.
   2. Ensuite, préparez un fichier de configuration YML contenant le nom du fichier, le chemin des outils (BWA, HISAT2, stringtie³⁴, samtools³⁵), le chemin d’accès aux fichiers de référence téléchargés (fichiers FASTA du génome de référence de l’hôte, fichiers d’annotation) et le chemin d’accès aux fichiers d’index de l’étape 2.1.1.
   3. Exécutez l’outil CIRIquant à partir du terminal en utilisant les paramètres par défaut ou manuels. L’utilisateur peut spécifier le type de bibliothèque (brin ou non) des données RNA-seq lors de l’exécution de l’outil CIRIquant.
      REMARQUE: Le type de bibliothèque des données RNA-seq peut être déterminé en connaissant le type de kit de préparation de bibliothèque utilisé. Si l’identité du kit de préparation de la bibliothèque est inconnue, un progiciel bioinformatique de contrôle ARN-seq appelé RSeQC³⁶ peut être utilisé pour déterminer le brins des données de séquençage de l’ARN.
2. Analyse d’expression différentielle
   REMARQUE: Le package CIRIquant comprend prep_CIRIquant, prepDE.py et CIRI_DE_replicate; Par conséquent, aucun téléchargement supplémentaire n’est nécessaire pour ces trois outils.
   1. Préparez un fichier texte (.lst) avec une liste de données contenant les éléments suivants :
      1^ère colonne : ID des données RNA-seq utilisées à l’étape 2.1.3
      2^ème colonne : chemin d’accès aux fichiers GTF générés par CIRIquant
      3^ème colonne : regroupement des données RNA-seq, qu’il s’agisse d’un groupe témoin ou traité.
   2. Pour obtenir un exemple, reportez-vous au tableau 1 ci-dessous.
      REMARQUE: Il n’est pas nécessaire de mettre les en-têtes car ils sont juste pour référence.
   3. Sur le terminal Linux, exécutez prep_CIRIquant avec le fichier texte (.lst) préparé à l’étape 2.2.1 en entrée. L’exécution génère une liste de fichiers : library_info.csv, circRNA_info.csv, circRNA_bsj.csv et circRNA_ratio.csv.
   4. Préparez un deuxième fichier texte avec une liste de données contenant les ID RNA-seq et le chemin d’accès à leur sortie StringTie respective. La mise en page du fichier doit être similaire au fichier texte de l’étape 2.2.1 sans la colonne de regroupement.
   5. Exécutez prepDE.py avec le fichier texte préparé à l’étape 2.2.4 en entrée pour générer les fichiers de matrice de numération des gènes.
   6. Exécutez CIRI_DE_replicate avec les fichiers library_info.csv et circRNA_bsj.csv de l’étape 2.2.3 et le fichier gene_count_matrix.csv de l’étape 2.2.5 comme entrées pour sortir le fichier circRNA_de.tsv final.
3. Filtrage des circRNAs DE
   1. Utilisez R (dans le terminal informatique ou RStudio) ou n’importe quel tableur (par exemple, Microsoft Excel) pour ouvrir le fichier circRNA_de.tsv généré à partir de l’étape 2.2.6 afin de filtrer et de déterminer le nombre de circRNA exprimés différentiellement (DE).
   2. Filtrer les circRNAs DE selon les critères LogFC > |2| et FDR < 0,05.
   3. Créez un fichier nommé DE_circRNAs.txt pour stocker les informations des circRNAs DE.

3. Caractérisation et annotation des circRNAs DE prédits

1. Statut d’annotation des circRNAs DE
   1. Chargez le fichier nommé DE_circRNAs.txt dans RStudio , qui consiste en la liste des circRNA DE filtrés à partir de l’étape 2.3.3. Inclure d’autres informations telles que les positions génomiques (Chr, Start, End), l’orientation des brins (+ ou -), le nom du gène et le type circRNA. Avant de continuer, convertissez les coordonnées génomiques circRNA de CIRIquant à 0 en soustrayant 1 paire de bases.
      REMARQUE: Les autres informations mentionnées ci-dessus peuvent être obtenues à partir des fichiers GTF générés par CIRIquant (Fichier supplémentaire 1).
   2. Déterminez l’état d’annotation des circRNA DE prédits en téléchargeant une bibliothèque contenant les positions génomiques des circRNA-database (par exemple, circBase) déposées circRNA.
      REMARQUE: Assurez-vous que la version du génome utilisée pour prédire les circRNA est identique à la bibliothèque de base de données circRNA avant de faire la comparaison. Le fichier de données circBase utilisé ici est disponible gratuitement dans le dossier du lecteur fourni dans Github (https://github.com/bicciatolab/Circr)³⁷.
   3. Une fois les fichiers de l’étape 3.1.1 et de l’étape 3.1.2 préparés, exécutez le script R fourni dans le fichier supplémentaire 1. Les emplacements chromosomiques des circRNA DE sont interrogés à la bibliothèque avant d’attribuer le statut Annoté ou Non annoté.
2. Caractérisation des circRNAs DE
   1. Utilisez R et d’autres tableurs pour résumer le nombre de circRNA en fonction des types de circRNA (c.-à-d. exon, intron, intergénique et antisens) et du nombre de gènes que les circRNA couvrent (1 ou >1) (fichier supplémentaire 1).REMARQUE: CIRIquant ne peut détecter que quatre types de circRNA (exon, intron, intergénique et antisens). Les circRNA d’exon-intron, également appelés ElciRNA, ne peuvent pas être détectés par CIRIquant.

4. Prédire l’interaction circRNA-miARN à l’aide de Circr

REMARQUE: Un manuel plus détaillé sur la façon d’installer et d’utiliser Circr pour l’analyse de l’interaction circRNA-miARN peut être trouvé à: https://github.com/bicciatolab/Circr³⁷.

1. Préparation des dossiers
   1. Décompressez et extrayez le contenu du fichier Circr.zip après l’avoir téléchargé à partir de la page GitHub Circr en utilisant le logiciel approprié tel que « WinRar » ou « 7-zip » dans un nouveau répertoire où l’analyse sera effectuée.
   2. Installez les applications logicielles prérequises (miRanda, RNAhybrid, Pybedtools et samtools) avant d’effectuer l’analyse circRNA-miRNA.
   3. Les génomes de référence et les fichiers d’annotation pour plusieurs organismes d’intérêt, le fichier de coordonnées de l’ARNr, le fichier d’interaction miARN validé et les fichiers circBase circRNA sont fournis par l’auteur de Circr dans la page Github (https://github.com/bicciatolab/Circr)³⁷. En cliquant sur les fichiers de support dans le dossier du lecteur, sélectionnez le dossier de l’organisme d’intérêt, le dossier miRNA et le fichier texte circBase et téléchargez-le.
   4. Après avoir téléchargé les fichiers nécessaires à l’étape 4.1.3, créez un nouveau répertoire nommé support_files dans le répertoire mentionné à l’étape 4.1.1. Ensuite, décompressez et extrayez le contenu dans le répertoire support_files .
   5. Indexez le fichier génome de référence de l’organisme d’intérêt à l’aide de la commande samtools faidx (Fichier supplémentaire 1).
   6. Préparez un fichier d’entrée comprenant les coordonnées des circRNA DE d’intérêt dans un fichier BED délimité par des tabulations, comme indiqué dans le tableau 2.
      REMARQUE: Étant donné que les circRNA prédits par CIRIquant ne sont pas basés sur 0, il est nécessaire de moins 1 pb à la coordonnée de départ (comme mentionné à l’étape 3.1.1) avant de les convertir au format BED. Les en-têtes indiqués dans le tableau 2 sont juste à titre de référence et ne sont pas nécessaires dans les fichiers BED.
   7. À ce stade, assurez-vous que l’arborescence de dossiers attendue pour l’analyse Circr est la même que dans la figure 2.
2. Exécution Circr.py
   1. Exécutez Circr.py à l’aide de Python 3 et, en tant qu’arguments, spécifiez le fichier d’entrée circRNA, le génome FASTA de l’organisme d’intérêt, la version génomique de l’organisme sélectionné, le nombre de threads et le nom du fichier de sortie dans la ligne de commande.
   2. Si l’organisme d’intérêt n’est pas fourni dans le dossier du lecteur répertorié à l’étape 4.1.3 ou si l’utilisateur préfère disposer d’un ensemble personnalisé de fichiers pour exécuter l’analyse, des commandes supplémentaires spécifiant l’emplacement de ces fichiers doivent être incluses lors de l’exécution de Circr.py.
   3. Une fois l’analyse Circr terminée, le programme génère un fichier d’interaction circRNA-miARN au format csv.
   4. Filtrez les résultats de l’interaction circRNA-miARN en fonction des préférences spécifiques à l’utilisateur. Pour cette étude, les prédictions sont filtrées à l’aide de Rstudio selon les critères ci-dessous :
      -Détecté par les trois outils logiciels
      -Deux sites de liaison ou plus signalés par Targetscan et miRanda
      -Identifié dans les colonnes « AGO » ou « validé »
      -Filtrer aucune interaction avec la région de graine
   5. Écrivez les circRNA qui passent les conditions filtrées de l’étape 4.2.3 dans un nouveau fichier texte nommé circRNA_miRNA.txt. Un tel filtrage peut augmenter la confiance des interactions prévues.

5. Construction du réseau ceRNA

REMARQUE: Un manuel détaillé sur la façon d’utiliser Cytoscape peut être trouvé à: http://manual.cytoscape.org/en/stable/ et https://github.com/cytoscape/cytoscape-tutorials/wiki#introduction

1. Téléchargement et préparation
   1. Téléchargez la dernière version de Cytoscape³⁸ à partir de : https://cytoscape.org/download.html.
   2. Exécutez l’assistant d’installation téléchargé à l’étape 5.1.1 et sélectionnez l’emplacement du fichier pour le logiciel Cytoscape.
   3. Préparez un fichier délimité par des tabulations contenant les circRNA d’intérêt et leur miARN cible. La première colonne se compose du nom circRNA; la deuxième colonne spécifie le type d’ARN de la première colonne; la troisième colonne est le miARN cible; et la quatrième colonne spécifie le type d’ARN de la troisième colonne. Un exemple du fichier est présenté dans le tableau 3.
2. Construction de la carte du réseau ceRNA
   1. Ouvrez le logiciel Cytoscape installé à l’étape 5.1.2.
   2. Dans Cytoscape, accédez à Fichier > Importer > Réseau à partir d’un fichier. Sélectionnez le fichier qui a été préparé à l’étape 5.1.3.
   3. Dans le nouvel onglet, sélectionnez la première et la deuxième colonne comme « Nœud source » et « Attribut du nœud source », tandis que sélectionnez la troisième et la quatrième colonne comme « Nœud cible » et « Attribut du nœud cible » respectivement. Cliquez sur OK et le réseau apparaîtra en haut à droite de Cytoscape.
   4. Pour changer le style visuel du réseau, appuyez sur le bouton Style sur le côté gauche de Cytoscape.
   5. Appuyez sur la flèche située à droite de Couleur de remplissage. Choisissez Type pour la colonne et Mappage discret pour le type de mappage. Ensuite, sélectionnez la couleur souhaitée pour chacun des types d’ARN.
   6. Après avoir modifié la couleur, modifiez la forme des nœuds en accédant à Forme et en suivant l’étape 5.2.5.

6. Analyse de l’enrichissement fonctionnel

1. Analyse de l’ontologie des gènes (GO) et de l’Encyclopédie des gènes et des génomes de Kyoto (KEGG) pour le gène parental des circRNA
   1. Assurez-vous que clusterProfiler ^39,40 et org. Hs.eg.db⁴¹ paquets ont été installés dans Rstudio. L’organisation. Le paquet Hs.eg.db⁴¹ est un paquet d’annotation à l’échelle du génome uniquement pour les humains. Si l’organisme d’intérêt est une autre espèce, reportez-vous à : https://bioconductor.org/packages/release/BiocViews.html#OrgDb
   2. Importez les informations DE_circRNA de l’étape 2.3.1 dans l’espace de travail Rstudio.
   3. Utilisez le gène parental des circRNAs fournis dans ce fichier pour l’analyse d’enrichissement dans les prochaines étapes. Cependant, si l’utilisateur souhaite convertir le symbole du gène dans d’autres formats, tels que l’ID Entrez, utilisez une fonction telle que « bitr ».
   4. En utilisant l’ID du gène comme entrée, exécutez l’analyse d’enrichissement GO à l’aide de la fonction enrichGO dans le package clusterProfiler^39,40 à l’aide des paramètres par défaut.
   5. En utilisant l’ID du gène comme entrée, exécutez l’analyse d’enrichissement KEGG à l’aide de la fonction enrichKEGG dans le package clusterProfiler^39,40 à l’aide des paramètres par défaut.

Le protocole enrôlé dans la section précédente a été modifié et configuré pour s’adapter au système d’exploitation Linux. La raison principale est que la plupart des bibliothèques de modules et des paquets impliqués dans l’analyse des circRNA ne peuvent fonctionner que sur la plate-forme Linux. Dans cette analyse, des ensembles de données de bibliothèques de séquences d’ARN ribosomique (ARNr) appauvries en ARN dépersonnalisées préparées à partir des cellules de macrophages humains infectées par le virus de la grippe A ont été téléchargés à partir de la base de données GEO⁴² et utilisés pour générer les résultats représentatifs.

Prédiction et quantification de l’ARNcir
Dans cette analyse, des ensembles de données de bibliothèques de séquences d’ARN appauvri en ARN ribosomique (ARNr) préparés à partir de cellules de macrophages humains infectées par le virus de la grippe A ont été utilisés pour effectuer la détection et l’analyse fonctionnelle de l’ARNc. Comme spécifié dans la section protocole, CIRIquant a été utilisé pour identifier et effectuer l’analyse DE des circRNA identifiés en utilisant les ensembles de données de la bibliothèque RNA-seq comme entrée. Les fichiers de référence utilisés sont basés sur la dernière version du génome humain (hg38). Le tableau 4 présente un exemple de résultat final de l’analyse CIRIquant. L’identification et le filtrage des circRNA DE à partir de la sortie CIRIquant ont été exécutés à l’aide de scripts RStudio simples (fichier supplémentaire 1). Les CircRNA ne sont classés comme DE que lorsque la valeur du taux de fausse découverte (FDR) est de <0,05 et que le changement de pli logarithmique (LogFC) >|2|. Le tableau 5 montre le nombre total de circRNAs et de circRNAs DE détectés. Au total, 35 846 circRNA ont été détectés, dont 306 DE. Les circRNAs DE détectés dans cette sortie sont entièrement régulés à la hausse (LogFC > 2), aucun n’étant régulé à la baisse (LogFC < 2).

Annotation et caractérisation des circRNAs DE
Statut d’annotation des circRNAs DE
Les circRNAs DE identifiés ont été recoupés avec une base de données circRNA établie, circBase. Cependant, étant donné que les coordonnées circRNA déposées dans circBase sont basées sur une version antérieure du génome humain (hg19), les coordonnées circRNA de circBase doivent être converties en version actuelle du génome humain (hg38) pour recoupement dans cette étude. En outre, la coordonnée de départ doit être convertie en base 0 à partir de la sortie de base 1 de CIRIquant. Les coordonnées circRNA de circBase converties en version hg38 sont fournies dans un dossier de lecteur dans Github (https://github.com/bicciatolab/Circr)³⁷. Ensuite, les scripts Rstudio (fichier supplémentaire 1) ont été utilisés pour attribuer le statut d’annotation des circRNA dans une nouvelle colonne de trame de données. Le tableau 6 montre un exemple de circRNA avec le statut d’annotation.

Caractérisation des circRNAs DE
Cette partie a été entièrement exécutée via des scripts R dans le logiciel RStudio. Les scripts R facilitent les processus analytiques et seules des connaissances de base sont requises.

Types de CircRNA
Dans cette étape, les circRNA DE ont été caractérisés par leurs types circRNA (Antisense, Exonic, Intergenic, et Intronic) en fonction de leurs positions génomiques. Le tableau 7 ci-dessous montre la répartition en pourcentage des différents types de circRNA englobés par les circRNA DE identifiés. Sur un total de 306 circRNA DE, 263 circRNA (85,95%) ont été identifiés comme étant des circRNA exoniques, qui est le type circRNA le plus abondant identifié. Les circRNA introniques sont le deuxième type de circRNA le plus identifié comprenant 17 circRNA DE, représentant jusqu’à 5,56% du total des circRNA DE. Viennent ensuite les circRNAs intergéniques (16 circRNAs DE ~5,23%) et les circRNAs antisens (10 circRNAs DE ~3,27%).

Nombre de gènes couverts par circRNA
Les ARNcirc identifiés par CIRIquant peuvent se chevaucher sur un certain nombre de gènes. À ce jour, la plupart des études sont axées sur les circRNA qui couvrent un gène. Par conséquent, dans ce protocole, les candidats circRNA couvrant plus d’un gène sont exclus de l’analyse en aval. Le tableau 8 ci-dessous décrit le nombre et le pourcentage de circRNA DE couvrant un et plusieurs gènes. Dans ce tableau, les circRNA intergéniques (16 circRNAs DE) sont exclus car ils ne chevauchent aucun gène hôte, tandis que les autres types de circRNA (290 circRNAs DE) sont soumis à cette analyse. Sur les 290 circRNA DE, la majorité des circRNA DE (261 circRNAs ~90%) ne couvrent qu’un seul gène, tandis que les 29 circRNAs restants (~10%) couvrent plus d’un gène.

Construction du réseau ceRNA
Un réseau de céRNA est généralement dessiné pour visualiser les interactions circRNA-miARN après qu’il a été prédit. Dans la figure 3 ci-dessous, un seul circRNA DE a été choisi comme résultat représentatif, qui est le circRNA hsa_DE_58. Sur la base des prédictions Circr, hsa_DE_58 peut éponger jusqu’à neuf miARN différents. Ces neuf miARN sont identifiés après filtrage à travers des critères stricts.

Analyse de l’enrichissement fonctionnel
Analyse GO et KEGG des gènes parentaux circRNA
La figure 4 ci-dessous représente un diagramme à bulles de l’enrichissement fonctionnel des gènes parentaux DE circRNA par l’analyse GO. Fondamentalement, l’analyse GO vise à démêler les processus biologiques, les emplacements cellulaires et les fonctions moléculaires qui sont enrichis ou affectés dans la condition étudiée, dans ce cas, l’échantillon infecté par le virus. L’enrichissement est considéré comme statistiquement significatif et représenté sur le graphique à bulles uniquement si la valeur de p est < 0,01. Comme le montre la figure 4, les trois principaux enrichissements pour les processus biologiques (BP) comprennent la biogenèse du complexe ribonucléoprotéique, la réponse au virus et la régulation de la réponse à un stimulus biotique, tandis que pour les fonctions moléculaires (MF), seule l’activité catalytique agissant sur l’ARN et la liaison à l’ARN simple brin sont statistiquement enrichies. En revanche, seul le complexe rétromère est statistiquement enrichi pour les composants cellulaires (CC).

La figure 5 montre l’analyse d’enrichissement KEGG des gènes parentaux DE circRNA dans un diagramme à bulles. À l’instar de l’analyse de l’enrichissement GO, l’enrichissement de KEGG n’est considéré comme statistiquement significatif et tracé sur un graphique à bulles que si la valeur de p est < 0,01. Seuls deux termes KEGG ont été enrichis dans ce cas, qui sont les voies de la grippe A et du cycle de vie viral (VIH-1).

Figure 1 : Le pipeline pour la prédiction et la caractérisation fonctionnelle des circRNA. Le pipeline montre un aperçu simple des étapes clés du début à la fin impliquant l’installation des progiciels nécessaires, la prédiction et la quantification de l’expression de circRNA, la construction du réseau ceRNA et l’exécution de l’enrichissement fonctionnel du gène parental circRNA. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Structure de l’arborescence des dossiers pour Circr. Cette arborescence de dossiers doit être établie avant d’exécuter le logiciel Circr afin de détecter les fichiers requis pour l’analyse. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : réseau ceRNA constitué de l’interaction circRNA-miRNA. La forme ovale bleue représente le circRNA, tandis que les triangles orange représentent les miARN. Les lignes continues reliant le circRNA aux miARN décrivent la fonction potentielle d’éponge des miARN du circRNA hsa_DE_58. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Graphique à bulles de l’analyse de l’enrichissement GO des gènes parentaux de l’ARNc DE. GeneRatio sur l’axe des x est le nombre de gènes dans la liste d’entrée associée au terme GO donné divisant le nombre total de gènes d’entrée. La taille des points dans le graphique est représentée par la valeur de comptage, qui est le nombre de gènes dans la liste d’entrée associée au terme GO donné. Plus la taille des points est grande, plus le nombre de gènes d’entrée associés au terme est important. En outre, les points du tracé sont codés par couleur en fonction de la valeur p. La valeur de p est calculée en comparant la fréquence observée d’un terme d’annotation avec la fréquence attendue par hasard. Les termes individuels sont considérés comme enrichis au-delà d’une valeur seuil (valeur de p < 0,01). Le dégradé de couleur de la valeur p allant du bleu au rouge indique un enrichissement croissant des termes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Analyse d’enrichissement KEGG des gènes parentaux circRNA DE. GeneRatio sur l’axe des x est le nombre de gènes dans la liste d’entrée associée au terme KEGG donné divisant le nombre total de gènes d’entrée. La taille des points dans le graphique est représentée par la valeur de comptage, qui est le nombre de gènes dans la liste d’entrée associée au terme KEGG donné. Plus la taille des points est grande, plus le nombre de gènes d’entrée associés au terme est important. En outre, les points du tracé sont codés par couleur en fonction de la valeur p. La valeur de p est calculée en comparant la fréquence observée d’un terme d’annotation avec la fréquence attendue par hasard. Les termes individuels sont considérés comme enrichis au-delà d’une valeur seuil (p-value < 0,01). Le dégradé de couleur de la valeur p allant du bleu au rouge indique un enrichissement croissant des termes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Préparation du fichier .lst de CIRIquant. Les chemins de destination des échantillons témoins et traités de la sortie CIRIquant sont écrits dans un fichier texte pour comparer les expressions de circRNA entre les deux types d’échantillons.

Tableau 2 : Exemple de fichier BED pour Circr. Six colonnes (Chr, Start, End, Name, Gene et Strand) associées aux circRNAs sont nécessaires pour générer le fichier BED.

Tableau 3 : Fichier d’entrée Cytoscape. Quatre colonnes (circRNA_name, Type, miRNA_name et Type) doivent être écrites dans un fichier texte.

Tableau 4 : Partie du fichier de sortie finale (.csv) de CIRIquant. CIRIquant fournit des informations telles que le LogFC, le nombre de logs par million (LogCPM), la régression logistique (LR), la valeur p, l’expression différentielle et le FDR.

Tableau 5 : Un résumé du nombre de circRNA totaux et exprimés différentiellement (DE) identifiés. Au total, 35 846 circRNA sont détectés, dont 306 sont des circRNA DE. Tous les 306 circRNA DE sont régulés à la hausse (aucun n’étant régulé à la baisse) dans les échantillons traités par rapport aux échantillons témoins.

Tableau 6 : Tableau des noms de circRNA personnalisés avec statut d’annotation. Les circRNAs sont interrogés dans une base de données de circRNAs déposés connus (circBase). Si le circRNA est présent dans la base de données, il est étiqueté pour être annoté, tandis que l’absence du circRNA est étiqueté comme non annoté.

Tableau 7 : Types de circRNAs identifiés. Les circRNA peuvent être classés en différents types de circRNAs en fonction de leur région de séquence, à savoir, exonique, intronique, antisens et intergénique.

Tableau 8 : Pourcentage de circRNA avec le nombre différent de gènes couverts. Les circRNA sont généralement codés à partir d’exons d’un gène, mais les circRNAs couvrant plus d’un gène peuvent également être détectés par CIRIquant.

Fichier supplémentaire 1 : Scripts utilisés dans le protocole. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Pour illustrer l’utilité de ce protocole, le séquençage de l’ARN provenant de cellules de macrophages humains infectées par le virus de la grippe A a été utilisé comme exemple. Les circRNA fonctionnant comme des éponges miARN potentielles dans les interactions hôte-pathogène et leur enrichissement fonctionnel GO et KEGG au sein d’un hôte ont été étudiés. Bien qu’il existe une variété d’outils circRNA disponibles en ligne, chacun d’eux est un package autonome qui n’interagit pas les uns avec les autres. Ici, nous rassemblons quelques-uns des outils nécessaires à la prédiction et à la quantification des circRNA, à l’enrichissement fonctionnel des circRNA, à la prédiction de l’interaction circRNA-miARN et à la construction du réseau ceRNA. Ce protocole simplifié permet de gagner du temps et peut être appliqué à des échantillons cliniques pour détecter les candidats circRNA avec des valeurs diagnostiques et pronostiques.

Essentiellement, nous avons utilisé CIRIquant³¹, un outil de quantification circRNA pré-emballé avec CIRI2, qui peut détecter et effectuer une analyse DE des circRNA. Les circRNAs DE sont filtrés en fonction d’une valeur seuil de LogFC > |2| et le FDR < 0,05, ce qui aide à éliminer les faux positifs potentiels dans les analyses en aval. La caractérisation des circRNA DE en termes de statut d’annotation, de types de circRNA et de nombre de gènes couverts aide à catégoriser et à filtrer davantage les candidats circRNA. Par la suite, Circr³⁷, un outil de prédiction circRNA-miRNA, est utilisé pour prédire les candidats potentiels à l’éponge miARN. Après avoir prédit les miARN potentiels en tant que cibles des circRNA, un réseau de ceRNA est dessiné. Enfin, sur la base des gènes parentaux des circRNA, le package R clusterProfiler³⁹ est utilisé pour l’annotation fonctionnelle via l’analyse d’enrichissement des voies GO et KEGG. Les résultats de GO et KEGG peuvent aider à démêler les mécanismes biologiques influencés par les circRNA.

À ce jour, plusieurs outils de prédiction de circRNA ont été développés, notamment CIRI2 43, CIRCexplorer2 44, find_circ 45, MapSplice⁴⁶ et UROBORUS ⁴⁷. Dans une étude menée par Hansen et al., CIRI2 aurait une performance globale élevée. C’est l’un des rares outils de détection de circRNA qui peut bien fonctionner en termes de prédiction de novo et de réduction de l’identification faussement positive⁴⁸. CIRIquant, qui utilise CIRI2 pour la détection et la quantification de circRNA, a donc été utilisé dans cette étude. CIRIquant a été utilisé pour compter les lectures de jonction d’épissure arrière (BSJ), et les données de comptage ont été normalisées aux lectures mappées pour cogner des ARN linéaires transcrits à partir des mêmes loci de gènes. Cela permet de quantifier les circRNA dans un échantillon. Pour déterminer l’expression différentielle des circRNA dans des conditions expérimentales, CIRIquant a implémenté un modèle linéaire généralisé dans edgeR⁴⁹ pour l’analyse DE, et le test exact-rapport de vitesse a été utilisé comme test statistique pour déterminer la signification de la différence dans le rapport de jonction circRNA. Bien que d’autres outils de quantification de circRNA tels que CIRCexplorer3-CLEAR⁵⁰ puissent être utilisés pour quantifier le niveau d’expression des circRNA, cet outil ne permet que la quantification circRNA dans un échantillon car il compte les lectures BSJ dans un échantillon et normalise les données de comptage par rapport aux comptes d’ARN linéaires apparentés du même échantillon. CIRCexplorer3-CLEAR ne peut pas comparer les expressions de circRNA dans des conditions expérimentales. De plus, aucun outil d’analyse statistique n’est implémenté dans CIRCexplorer3-CLEAR pour soutenir le niveau d’expression quantifié. Bien que l’outil de prédiction circRNA par défaut implémenté dans CIRIquant soit CIRI2, les résultats de prédiction d’autres outils tels que find_circ et CIRCexplorer2 peuvent également être utilisés pour la quantification et l’analyse DE³¹. Dans ce protocole, un seul outil de prédiction circRNA (CIRI2) a été utilisé pour la prédiction, ce qui pourrait encore produire des candidats circRNA faussement positifs. Pour réduire les faux positifs, on peut combiner d’autres outils de prédiction de circRNA pour l’analyse et sélectionner les circRNAs communs détectés parmi les différents outils de prédiction circRNA^48,51. Pour améliorer encore la détection des circRNA, il est idéal d’utiliser des ensembles de données de séquençage de l’ARN qui sont à la fois appauvris en ARNr et soumis à un prétraitement de la RNase R.

Selon l’objectif de l’étude, les circRNA DE de novo et annotés peuvent être identifiés séparément sur la base de la base de données circBase⁵². Cependant, les circRNA couvrant plus d’un gène nécessitent souvent un examen manuel sur UCSC ou tout autre navigateur génomique pour déterminer l’authenticité des circRNA et éliminer les faux positifs. Néanmoins, des circRNAs qui couvrent plus d’un gène, tels que les circRNAs dérivés de gènes de fusion, ont également été signalés récemment^53,54.

Circr fonctionne en combinant trois algorithmes de prédiction miARN-ARNm différents, à savoir TargetScan⁵⁵, miRanda 56 et RNAhybrid⁵⁷ pour prédire les sites de liaison circRNA-miARN. En plus de cela, l’algorithme intègre également des informations sur les pics d’AGO et les interactions précédemment validées dans l’analyse circRNA-miARN. Ici, des critères de filtrage stricts ont été appliqués pour permettre une prédiction circRNA-miARN plus fiable, réduisant ainsi davantage les faux positifs. Cependant, la rigueur de cette étape de filtrage peut être définie à la hausse ou à la baisse en fonction des préférences de l’utilisateur.

ClusterProfiler est un package R bien documenté qui peut annoter fonctionnellement des ensembles de gènes dans divers organismes. Outre les fonctions du paquet R clusterProfiler mentionnées dans ce protocole (enrichGO et enrichKEGG), qui utilisent l’analyse de surreprésentation, il existe également d’autres fonctions telles que gseGO et gseKEGG qui peuvent être utilisées. Si clusterProfiler n’est pas un choix approprié pour le flux de travail, il existe également d’autres outils et packages tels que « AllEnricher"⁵⁸ ou les outils basés sur des sites Web tels que « Metascape"⁵⁹ qui peuvent annoter fonctionnellement un ensemble de gènes. Enfin, bien que le pipeline fourni ci-dessus aide à prédire les circRNA potentiels et leurs annotations fonctionnelles, une vérification en laboratoire humide sera nécessaire pour fournir des preuves solides.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L’auteur tient à remercier Tan Ke En et le Dr Cameron Bracken pour leur examen critique de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par des subventions du programme de subventions de recherche fondamentale (FRGS / 1 / 2020 / SKK0 / UM / 02/15) et de la subvention de recherche à fort impact de l’Université de Malaisie (UM. C/625/1/HIR/MOE/CHAN/02/07).