Estamos tratando de determinar el mejor método a utilizar para la predicción de la importancia de los anticuerpos contra los glóbulos rojos. El ensayo monocito-macrófago parece ser más sensible que el ensayo monocapa de monocitos. Por lo tanto, la pregunta que estamos tratando de responder es si el ensayo de monocitos y macrófagos es un mejor ensayo para la predicción de la importancia de los anticuerpos contra los glóbulos rojos, mejor que el ensayo de monocapa de monocitos.
Los desafíos experimentales con el ensayo de monocapa de monocitos y el ensayo de monocitos y macrófagos están optimizando su eficiencia para permitir una finalización más rápida, al tiempo que eliminan la necesidad de una evaluación manual de la fagocitosis. En otras palabras, el reto es tratar de semiautomatizar estos ensayos. El ensayo de monocapa de monocitos, del que fui pionero en 1980, ha sido utilizado de forma rutinaria por el Laboratorio de Referencia de Inmunohematología desde 1983 para ayudar a decidir qué autoanticuerpos o aloanticuerpos de glóbulos rojos tienen el potencial de causar hemólisis cuando la sangre del donante se transfunde a pacientes que tienen estos anticuerpos.
Por lo tanto, la MMA utiliza monocitos en el ensayo, pero la hemólisis mediada por anticuerpos suele estar causada por macrófagos en el bazo o el hígado. Por lo tanto, aquí estamos explorando si el uso de macrófagos primarios en este ensayo sería mejor que los monocitos como predictores de la posible importancia clínica de los anticuerpos. Tratar de hacer que el ensayo de monocitos y macrófagos sea más fácil de usar, más rápido y que no requiera microscopía óptica, pero tal vez sería deseable un mecanismo automatizado para leer la fagocitosis.
Para comenzar, diluya toda la sangre con RPMI-1640 Complete Medium y colóquela en capas sobre un medio de gradiente de densidad para la centrifugación. Después de la centrifugación, recupere la capa leucocitaria que contiene células mononucleares de sangre periférica o PMBC. Después de peletizar los PBMC obtenidos, vuelva a suspenderlos en 10 mililitros de RPMI-1640 Complete Medium precalentado.
Determine el número de células utilizando el equipo adecuado antes de iniciar el proceso de aislamiento de monocitos. Siga las instrucciones del kit de aislamiento de monocitos y transfiera la muestra a un tubo de propileno del tamaño adecuado. Agregue el cóctel de enriquecimiento a la muestra a una concentración de 50 microlitros por mililitro de la muestra.
Después de pipetear la muestra hacia arriba y hacia abajo, véncela para mezclarla bien e incubar la muestra a dos u ocho grados centígrados durante 10 minutos en una cubeta de hielo. Ahora, vórtice las partículas magnéticas durante 30 segundos durante este período de incubación. Después de la incubación, agregue partículas magnéticas a la muestra a una concentración de 100 microlitros por mililitro de muestra.
Agite la muestra en vórtice e incubela a una temperatura de dos a ocho grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, añada el medio de aislamiento para aumentar el volumen a 2,5 mililitros o 10 mililitros, según sea necesario, utilizando una pipeta graduada, y mezcle. A continuación, coloque el tubo de propileno sin tapa en el imán e incube a temperatura ambiente durante unos 2,5 minutos.
A continuación, levanta el imán e inviértelo con un movimiento continuo para verter la suspensión de la célula en un nuevo tubo de 5 o 14 mililitros. Vuelva a suspender las células aisladas en el medio RPMI-1640. Para empezar, añada cinco mililitros de solución de poli-D-licina a un matraz de 25 mililitros para cada población de macrófagos, M1 y M2, y deje los matraces en la campana durante al menos una hora.
Después de determinar el recuento de células, agregue cinco mililitros de RPMI-1640 Medium, luego siembre entre una y cinco veces, 10 a la potencia de seis monocitos en cada matraz precodificado de 25 mililitros. Incubar el matraz a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante al menos dos horas. Después del período de incubación, lave el matraz una vez con PBS y dos veces con RPMI-1640 Medium completo.
Agregue 10 mililitros de medio de diferenciación M1 o M2 al matraz de acuerdo con el tipo de celda deseado, y deje que las celdas se diferencien en la incubadora durante seis días a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono. En el sexto día, agregue cinco mililitros de medio de polarización M1 o M2 a cada matraz según sea necesario. Deje que los macrófagos se polaricen en la incubadora a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante al menos dos días.
Antes de cosechar macrófagos M1 o M2 en el octavo día, recoja el sobrenadante en un tubo de 15 mililitros para su uso posterior, si es necesario. Agregue un mililitro de solución de desprendimiento de células al matraz e incube. Para detener la reacción, agregue tres mililitros de medio RPMI-1640 completo al matraz y recoja el medio en un tubo de 15 mililitros.
Después de agregar otros tres mililitros de medio al matraz, use un raspador de celdas para separar las celdas del fondo. Recoja las células desprendidas en un tubo nuevo de 15 mililitros. Para determinar la calidad de los macrófagos M1 y M2, lave las células dos veces con PBS y vuelva a suspender en el medio RPMI-1640 completo a 0,5 veces, 10 a la potencia de seis células por tubo.
A continuación, analice las dos poblaciones de células mediante un ensayo de citometría de flujo. Cuente los macrófagos M1 y M2 obtenidos utilizando un hemocitómetro en una proporción de tinción de uno a uno con azul de tripán. Reconstituya los macrófagos a una concentración de 1 por 10 elevado a la potencia de seis células por mililitro en RPMI-1640 Medio Completo.
Con una micropipeta, siembre 400 microlitros de la suspensión celular en cada pocillo del portaobjetos de la cámara de ocho pocillos e incube el portaobjetos a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante al menos 1,5 horas en una incubadora de cultivo de tejidos totalmente humidificada. Para lavar los glóbulos rojos R2R2 RhD positivos, añada PBS a pH 7,4 a las células y centrifugue la muestra a 350 g durante cinco minutos. Después de dos lavados más, opsonice la muestra de glóbulos rojos de prueba con los anticuerpos de interés.
Incubar los glóbulos rojos opsonizados y no opsonizados de anticuerpos a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante una hora. Vórtice intermitentemente cada 15 minutos para evitar que los glóbulos rojos se asienten. A continuación, lave los glóbulos rojos opsonizados tres veces con PBS a pH 7,4, como se ha demostrado anteriormente.
Para comprobar la opsonización de glóbulos rojos, realice una prueba de antiglobulina indirecta con un anticuerpo antihumano opsonizante secundario frente al anticuerpo opsonizante primario. Después de leer la prueba de antiglobulina indirecta, reconstituya los glóbulos rojos opsonizados RHD más R2R2 lavados en una suspensión de 1.25%volumen por volumen con RPMI-1640 Complete Medium. Después de la incubación de 1,5 horas de los macrófagos M1 y M2, aspire y deseche el medio sobrenadante suavemente a lo largo de la esquina del pocillo.
A continuación, añada 400 microlitros de la mezcla de glóbulos rojos opsonizados al 1,25% a cada pocillo de la configuración de triplicado. Incubar la muestra a 37 grados centígrados con 5% de dióxido de carbono durante dos horas sin perturbar. Ahora vierta 100 mililitros de PBS a pH 7.4 en dos vasos de precipitados.
Sumerja la corredera en el primer vaso de precipitados y muévala lentamente hacia adelante y hacia atrás durante 20 a 30 pasadas. A continuación, transfiera el portaobjetos al segundo vaso de precipitados y lávelo de 20 a 30 pasadas. Retire el portaobjetos del PBS y frote el exceso de líquido con una toalla de papel.
Sumerja el portaobjetos en metanol al 100% durante 45 segundos para fijar las células. Seque al aire la guía y móntela utilizando un medio de montaje preparado internamente. Agregue cubreobjetos y deje que el portaobjetos se seque durante la noche antes de cuantificar la fagocitosis.
Los macrófagos M1 y M2 se polarizaron y cultivaron con éxito durante ocho días con características morfológicas distintivas observadas en las imágenes de microscopía. En la citometría de flujo, los macrófagos M1 mostraron una expresión de aproximadamente el 86,1% de CD80 y el 0,17% de CD209. Los macrófagos M2 mostraron el 97,3% de la expresión de CD209 y el 0,003% de la expresión de CD80.
Los histogramas de la intensidad de fluorescencia confirmaron una mayor expresión de CD80 en los macrófagos M1 en comparación con los macrófagos M2. Mientras que los macrófagos M2 mostraron una expresión de CD209 significativamente mayor en comparación con los macrófagos M1. Los macrófagos M2 mostraron un índice fagocítico significativamente más alto en comparación con los macrófagos M1.
Las imágenes de microscopía mostraron una clara evidencia de un aumento de la fagocitosis en los macrófagos M2 en comparación con los macrófagos M1. Este estudio tuvo como objetivo evaluar el potencial del uso de macrófagos en lugar de monocitos para predecir la importancia de los anticuerpos contra los glóbulos rojos. Esta tabla muestra que los macrófagos M2 fagocitan mejor que los macrófagos M1 o monocitos con anticuerpos considerados clínicamente significativos.
Por lo tanto, con estudios adicionales, se puede utilizar un ensayo con macrófagos M2 para una mejor predicción de la importancia clínica de los anticuerpos.
