Estamos tratando de descubrir nuevos tipos de química para combatir los patógenos agrícolas. Utilizando la tecnología iChip, hemos aislado nuevos organismos, que esperamos conduzcan a una nueva química. Las pruebas de estos organismos y/o sus productos naturales contra patógenos agrícolas pueden conducir a la búsqueda de nuevos organismos y/o compuestos candidatos a bioplaguicidas.
El método iChip nos permite aislar microorganismos que no son cultivables en condiciones convencionales proporcionando un período de domesticación y contacto con su entorno natural. Nuestra construcción de iChip modificada es simple, económica y reduce el riesgo de contaminación microbiana, lo que lo hace fácilmente accesible para una variedad de objetivos de investigación. Los resultados de nuestro iChip abren preguntas como ¿qué mecanismos impulsan la supresión de patógenos por parte de nuevos microbios?
¿Pueden estos compuestos bioactivos funcionar de forma fiable en ensayos del mundo real? ¿Cómo influyen los factores ambientales en su eficacia? Abordar estas preguntas guiará el desarrollo sostenible de bioplaguicidas, transformando el manejo de enfermedades de las plantas y reduciendo la dependencia de los fungicidas sintéticos.
El laboratorio aplicará la tecnología iChip para aislar nuevas bacterias de suelos supresores de enfermedades producidos a través de cultivos de cobertura, identificando nuevos microbios y compuestos bioactivos. Estos se probarán en estudios de enfermedades controladas de plantas para desarrollar alternativas innovadoras y sostenibles a los fungicidas sintéticos para el manejo de enfermedades agrícolas. Para construir un iChip modificado utilizando una herramienta perforadora de agar de 5 milímetros, retire el fondo de los pocillos de una placa de 96 pocillos.
Corte membranas de policarbonato de 0,05 micrómetros en rectángulos, asegurándose de que las dimensiones coincidan con el área inferior de una placa de 96 pocillos. Aplique un sellador de silicona para adherir la membrana de policarbonato a la parte inferior de la placa de 96 pocillos. Asegúrese de que el adhesivo selle los pocillos, pero no cubra completamente las aberturas de los pozos.
Deje que las placas se sequen durante 24 horas. Agregue 4.5 mililitros de agua estéril a cada uno de los tubos de centrífuga de 15 mililitros etiquetados de la A a la D, y a cada uno de los tubos de 50 mililitros etiquetados de la E a la H. Agregue 1 gramo de tierra en un tubo de centrífuga de 50 mililitros. Luego agregue 10 mililitros de agua al tubo y agite la mezcla durante 10 minutos.
Deje que la suspensión del suelo se asiente durante 10 minutos. A continuación, pipetee 0,5 mililitros del sobrenadante de tierra en el tubo A y mezcle bien. Ahora, transfiera 0,5 mililitros de la suspensión celular del tubo A al tubo B y mezcle bien.
Repita para todos los tubos de centrífuga restantes, completando una serie de diluciones diez veces a través de los ocho tubos. Para empezar, sumerja los iChips completamente en etanol al 95%. Después de 15 minutos, retire las placas del etanol y colóquelas sobre una toalla de papel estéril en la campana de flujo laminar.
Deje que el etanol se evapore mientras enciende el esterilizador ultravioleta en la campana de flujo laminar durante 15 minutos. Pipetee 360 microlitros de sales mínimas de succinato estéril o medios SMS en la primera columna de la placa para que sirva como control. Agregue 45 mililitros de SMS a la suspensión celular en el tubo E.Mezcle bien para combinar la suspensión celular con el agar.
Pipetee 360 microlitros de la mezcla de células de agar en todos los pocillos restantes de la placa de 96 pocillos. Una vez que el medio esté configurado, selle la parte superior de la placa con una cubierta de placa PCR. Llene las placas con los tubos F, G y H para preparar un total de cuatro placas con diferencias de concentración diez veces mayores.
Coloque las placas en un recipiente que contenga aproximadamente 1 pulgada de tierra con el lado de la membrana hacia abajo. Incubar las placas dentro del recipiente tapado en la oscuridad a 25 grados centígrados. Después de seis semanas, examine los iChips para ver si hay crecimiento microbiano.
Enjuague el iChip modificado tres veces con agua estéril para eliminar todas las partículas de tierra. Limpie la parte superior y los lados de la placa con etanol al 95%, evitando el lado con la membrana semipermeable. Con una cuchilla estéril, corte la cubierta de la placa alrededor de un pocillo que contenga una colonia y retire el cuadrado con pinzas estériles.
Con una herramienta de rayado estéril, perfore la colonia y raye en la placa de agar SMS con el método de cuatro cuadrantes. Incubar las placas a 25 grados centígrados durante una semana o hasta que se observe el crecimiento de la colonia. Después de la incubación, examine las colonias para confirmar el aislamiento de los cultivos.
