Por lo tanto, nuestra investigación se refiere a las adaptaciones bacterianas a la limitación del zinc que van más allá de la conservación del zinc. Así que utilizamos las bacterias patógenas, Mycobacterium tuberculosis, y las no patógenas, Mycobacterium smegmatis, para ver cómo la limitación del zinc afecta a cosas como la fisiología bacteriana y la patogénesis. Otra cosa que nos interesa son las proteínas ribosómicas alternativas, que son expresadas por muchas bacterias durante la limitación de zinc, pero todavía no sabemos mucho sobre ellas.
Tanto las micobacterias patógenas como las no patógenas mostraron respuestas drásticas a la limitación del zinc, con niveles de expresión en cientos de genes y proteínas influenciados por la disponibilidad del micronutriente zinc. Fisiológicamente, esto da como resultado una morfogénesis profunda para Mycobacterium smegmatis y una respuesta al estrés oxidativo significativamente regulada tanto en Mycobacterium smegmatis como en Mycobacterium tuberculosis patógena. Este protocolo aborda la dificultad para reproducir y estandarizar las condiciones para el crecimiento limitante de zinc en la producción de ribosomas alternativos traduccionalmente activos en micobacterias.
Observamos factores fuera de nuestro control, como un evento de lluvias intensas, que se correlacionan con la contaminación por zinc y la preparación limitada de medios de zinc. El fenotipo bioindicador presentado aquí garantiza la reproducibilidad de los resultados de crecimiento limitantes del zinc. El fenotipo bioindicador cuantificable descrito aquí permite lograr condiciones limitantes de zinc sin el uso de agentes quelantes.
Por lo tanto, permite la producción estandarizada de ribosomas alternativos traduccionalmente activos y aplicaciones posteriores como macrófagos o infecciones animales para estudiar las interacciones huésped-patógeno. Por lo tanto, nuestro laboratorio está trabajando en la comprensión de las funciones específicas de cada proteína ribosómica alternativa y cómo la incorporación de esas proteínas en los ribosomas podría afectar la traducción. Y también estamos tratando de ver si los resultados que vemos en M. smegmatis también se pueden aplicar a la MTB, y si se pueden usar para desarrollar mejores tratamientos contra la tuberculosis.
Para comenzar, agregue cinco mililitros de medio 7H9-ADC a un tubo de biorreactor de 50 mililitros. A continuación, añada 10 microlitros de células madre de glicerol descongeladas de Mycobacterium smegmatis y enrosque la tapa en el tubo. Coloque el tubo firmemente en un ángulo de aproximadamente 45 grados e incube a 37 grados Celsius con 120 rpm durante 18 horas.
Después de la incubación, mida la densidad óptica a 600 nanómetros y confirme que es de alrededor de 0,5 a 0,8. Centrifugar el cultivo a 3000 x g durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en cinco mililitros de medios limitados en zinc, o ZLM.
Durante la centrifugación, esterilice una cubeta llenándola con etanol al 70% hasta que se desborde y déjela reposar durante 10 minutos. A continuación, enjuague la cubeta tres veces con ZLM. Después de la centrifugación final, vuelva a suspender el pellet celular en dos mililitros de ZLM.
Limpie el espectrofotómetro con 600 microlitros de ZLM en una cubeta. Transfiera 600 microlitros de células lavadas a la cubeta esterilizada y mida la absorbancia a 600 nanómetros. Si la densidad óptica está por encima de uno, use la fórmula dada.
Para calcular el volumen de ZLM que se debe agregar a los 600 microlitros de celdas lavadas en la cubeta para obtener una densidad óptica de uno, agregue el volumen calculado de ZLM a la cubeta. Mezcle bien pipeteando de cinco a 10 veces y vuelva a medir la absorbancia. A continuación, añada 50 mililitros de ZLM en el matraz Erlenmeyer estéril de plástico de 250 mililitros esterilizado en doble autoclave.
Inocular los matraces añadiendo 50 microlitros del cultivo ajustado a una densidad óptica de uno de la cubeta. Para medios repletos de zinc, agregue 30 microlitros de sulfato de zinc de 10 milimolares para lograr una concentración final de seis micromolares. Incubar el cultivo a 37 grados centígrados con agitación a 100 rpm durante tres días para llegar a la fase estacionaria.
Cada día de crecimiento, agregue 200 microlitros de cultivo en una microplaca de fondo plano de 96 pocillos y mida las métricas de crecimiento en un lector de microplacas monocromador. Para informar de la densidad de celdas obtenida de un lector de microplacas, genere una curva estándar para convertir la lectura de la longitud de la ruta utilizando un volumen establecido a la longitud de la ruta estándar de un centímetro. Establezca la longitud de onda de excitación en 420 nanómetros y la emisión en 475 nanómetros para medir la fluorescencia del cofactor F420.
A continuación, ajuste la longitud de onda de excitación a 375 nanómetros y la longitud de onda de emisión a 475 nanómetros para medir la fluorescencia de fondo. Genere un escaneo de intensidad de fluorescencia desde la excitación a 230 nanómetros hasta 440 nanómetros en pasos de cinco nanómetros, con emisión fija a 475 nanómetros. Usando la siguiente ecuación, calcule el porcentaje de intensidad de fluorescencia de 375 nanómetros a 420 nanómetros.
Después de tres días, para registrar la longitud de la celda, limpie un portaobjetos de vidrio y cubra el portaobjetos con una toallita sin pelusa. Pipetee una gota de cultivo de 10 microlitros en el portaobjetos y coloque el cubreobjetos. Presione suavemente el cubreobjetos para que el cultivo se extienda y llene casi toda el área que se encuentra debajo.
Usando un microscopio compuesto con inmersión en aceite 100X y objetivos oculares 10X Con el accesorio de la cámara, visualice el portaobjetos preparado. Tome fotografías de áreas con varias celdas que estén enfocadas en el plano y no se muevan. Usando el mismo microscopio y objetivo, tome una imagen de un portaobjetos de calibración.
En el software Fiji, seleccione la herramienta de línea recta y dibuje una línea a lo largo de la corredera de calibración. Seleccione Analizar, seguido de Establecer escala e introduzca la distancia conocida en unidades para la barra de escala. A continuación, seleccione global para aplicar la escala a todas las imágenes y mediciones.
Ahora abra la imagen y use la herramienta de línea recta para dibujar una línea a lo largo de la longitud de la celda para medirla. Copie los datos de longitud de celda de la ventana emergente en una hoja de cálculo o guárdelos como un archivo de valores separados por comas para el análisis estadístico. Los cultivos de tipo silvestre cultivados en ZLM mostraron valores de densidad óptica más bajos en comparación con los medios repletos de zinc, con cepas delta altRP con valores aún más bajos.
La elongación celular se observó en cultivos de tipo salvaje ZLM con una longitud celular promedio de nueve micrómetros, mientras que las células repletas de zinc fueron más cortas, alrededor de tres micrómetros. Las células delta altRP no mostraron una elongación significativa en condiciones limitadas por zinc. Las exploraciones de fluorescencia mostraron una disminución de la fluorescencia del cofactor F420 en cultivos de tipo salvaje ZLM, y las cepas de delta altRP mostraron una variabilidad de fluorescencia mucho mayor.
