Trasplante quirúrgico de células tumorales en la médula espinal de ratones

El objetivo de nuestra investigación es desarrollar un modelo murino de glioma de médula espinal. Nuestro objetivo es responder a preguntas como, ¿cómo se puede mejorar la reproducibilidad del modelo? ¿Cuáles son las técnicas quirúrgicas optimizadas para la implantación de células tumorales?

¿Y cómo puede ayudar este modelo a desarrollar un tratamiento eficaz para el glioma de la médula espinal? Los retos experimentales actuales radican principalmente en tres aspectos. En primer lugar, la práctica de definir la posición de inyección en la médula espinal es difícil.

En segundo lugar, es crucial minimizar la división de las células después de la inyección. Por último, reducir el daño físico a la médula espinal durante el proceso requiere habilidades operativas refinadas. Nuestro protocolo abordó la brecha de investigación en los modelos existentes de glioma de médula espinal murino.

Los modelos actuales a menudo carecen de reproducibilidad y optimización en las técnicas quirúrgicas. Nuestro objetivo es impulsar esto mediante el desarrollo de un modelo más confiable con métodos de inyección precisos y minimizar el daño físico para mejorar la investigación y la exploración del tratamiento. Para comenzar, cultive la línea celular GL261-luciferasa en el DMEM completo hasta la fase de crecimiento logarítmico.

A continuación, lavar las células tumorales dos veces con PBS estéril e incubar con una solución de tripsina EDTA al 0,05% durante tres minutos. Transfiera la suspensión celular resultante a un nuevo tubo y centrifugue a 500 G durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante con una pipeta y vuelva a suspender el pellet en PBS.

A continuación, tiñe las células con azul de tripán y cuenta las células viables con un contador de células. Prepare la suspensión celular a una concentración de cinco veces 10 a la potencia de seis celdas por mililitro en PBS estéril. Para comenzar, coloque el ratón anestesiado en una mesa quirúrgica.

Exponga la piel y prepare una ventana quirúrgica limpia. Después de afeitar el vello de la región dorsal del cuello, desinfecte la piel con una solución de yodo, seguido de un paño con alcohol al 75% para la desyodación. Coloque el ratón con el lado dorsal hacia arriba y asegure las extremidades a la mesa con cinta médica.

Coloque una almohadilla de gasa de uno a dos centímetros de grosor debajo del área del cuello para brindar soporte y proporcionar un mejor acceso a la médula espinal. A continuación, con un bisturí quirúrgico y una cuchilla, haga una incisión longitudinal de aproximadamente 1,5 centímetros a lo largo del cuello. Separe suavemente los músculos del cuello con una disección roma, evitando lesiones a los vasos sanguíneos.

Ahora diseccione cuidadosamente los músculos adyacentes a las vértebras cervicales para exponer la séptima apófisis vertebral espinosa cervical, un punto de referencia óseo distintivo en ratones. Ajuste el punto de punción a 0,5 a 0,9 milímetros de la línea media de la columna vertebral. Enjuague bien una jeringa de aguja plana de 10 microlitros con PBS estéril dos o tres veces.

Extraiga dos microlitros de la suspensión de células tumorales en la jeringa sin introducir burbujas de aire. Estabilice la apófisis espinosa vertebral cervical agarrándola suavemente y levantándola con pinzas. Use una aguja biselada para perforar la duramadre.

Luego, cambie a una jeringa de aguja plana para inyectar las células tumorales. Después de la inyección, cierre la incisión cutánea suturando con una sutura de nailon 3/0. 10 días después de la cirugía, los ratones inoculados con células GL261-luciferasa mostraron debilidad en las extremidades traseras y una pérdida de peso significativa de aproximadamente el 20% con una tasa de supervivencia disminuida, progresando a parálisis de las extremidades posteriores con tumores, confirmada mediante imágenes bioluminiscentes, visualización macroscópica y examen histológico.

El modelo de melanoma B16-F10 mostró una progresión tumoral similar a la de GL261 con imágenes bioluminiscentes y visualización macroscópica, lo que confirmó el establecimiento de un tumor de la médula espinal junto con la pérdida de peso y la mortalidad en un plazo de 18 días. El análisis postoperatorio mostró lesiones leves de la médula espinal que se resolvieron en tres horas en 54 ratones y lesiones moderadas en tres ratones que se resolvieron en tres días. Los ratones con lesiones moderadas mostraron una pérdida de peso corporal más significativa en comparación con aquellos con lesiones leves.