Ensayo de ligando de proximidad para localizar proteínas en sitios de daño en el ADN

La respuesta al daño del ADN es un sistema celular que mantiene la estabilidad e integridad del genoma. Las disfunciones en este proceso causan varias enfermedades, como el cáncer, las enfermedades relacionadas con la edad y la inflamación crónica. Nuestro objetivo es identificar proteínas que cooperen en este proceso, lo que permite la identificación de dianas alternativas para la integración terapéutica.

Para caracterizar la participación de una proteína en la respuesta al daño del ADN, se suelen aplicar estudios de inmunofluorescencia con la forma fosforilada de la histona H2AX, un marcador de daño en el ADN. Además, los ensayos de recolección de proteínas, como la coinmunoprecipitación, se pueden realizar después del daño en el ADN para identificar el papel de la proteína en la señalización. Los estudios de interacción suelen basarse en ensayos de inmunoprecipitación, pero estos son in vitro y no proporcionan información sobre la ubicación de la interacción.

La inmunofluorescencia puede proporcionar información sobre la localización celular de las proteínas, pero demostrar la interacción puede ser difícil y depende de la resolución del microscopio. Demostramos aquí que un protocolo simple que combina el ensayo de ligando de proximidad con la tinción Gamma-H2AX permite la caracterización espacial y temporal de la interacción de las proteínas en el contexto de daño del ADN. Además, hemos proporcionado una macro fácil de usar para el análisis de datos.