Los organoides renales cultivados in vitro permanecen inmaduros, lo que limita su aplicabilidad. Y este método de trasplante intracelómico induce la vascularización y mejora la maduración de los organoides. El procedimiento es muy eficiente, lo que permite el trasplante y análisis de un gran número de organoides en un solo experimento.
Después de preparar organoides renales derivados de HIPSC e incubar los huevos fertilizados de leghorn, cree una ventana en la cáscara del huevo en el tercer día de incubación. Coloque un pequeño trozo de cinta transparente en la punta puntiaguda del huevo. Haga un pequeño agujero en la cáscara del huevo en el medio de la cinta transparente golpeándola con el extremo afilado de un par de tijeras de disección.
Luego, inserte una aguja de calibre 19 en una jeringa de cinco mililitros en el orificio en un ángulo de 45 grados. Aspire de dos a tres mililitros de albúmina del huevo para bajar el embrión dentro del huevo. Oculte el agujero con un segundo trozo de cinta transparente, luego coloque un trozo grande de cinta transparente en el lápiz marcado hacia arriba mirando hacia el lado del huevo.
Haga un agujero en la cáscara del huevo en el medio de la cinta transparente golpeándola con el extremo afilado de un par de tijeras de disección. Corta una pequeña ventana circular en la cáscara del huevo de este agujero usando tijeras curvas de disección. Mire a través de esta ventana para localizar el embrión.
Luego, amplíe la ventana para optimizar el acceso al embrión. Retire cualquier trozo grande de cáscara de huevo que pueda haber caído encima del embrión con fórceps. Retire los trozos más pequeños colocando unas gotas de DPBS con calcio y magnesio en el embrión con una pipeta de transferencia de plástico, luego aspirando el DPBS con la cáscara de huevo en la pipeta.
Usando una pipeta de transferencia de plástico, agregue tres gotas de DPBS, complementadas con estreptomicina al huevo al 0,5%. Selle cuidadosamente la ventana con un trozo grande de cinta transparente antes de volver a colocar el huevo en la incubadora hasta el cuarto día de incubación. Corte la cinta de la ventana con tijeras curvas de disección.
Coloque el huevo bajo un microscopio de disección en un soporte de goma o cartón de huevo. El embrión de pollo está ahora en Hamburger-Hamilton Stage 23 a 24 y está acostado sobre su lado izquierdo con su lado derecho mirando hacia el espectador. Localice el ala derecha y la yema de la pierna del embrión, ya que el celoma se evaluará entre estas dos yemas de las extremidades.
En el área entre el ala derecha y el brote de la pierna, cree una abertura consecutiva en la membrana vitelina, el corion y el amnios sosteniéndolos con dos pares de pinzas de disección y tirando suavemente de ellos en direcciones opuestas. Compruebe si hay acceso sin obstrucciones a la cavidad celómica. Agarre suavemente el borde de la pared del cuerpo entre el ala y el brote de la extremidad con un par de pinzas de disección y tire ligeramente hacia el espectador.
La cavidad celómica debe ser claramente visible. Inserte con cuidado un instrumento romo pero delgado en la cavidad celómica. Coloque la mitad de un organoide dentro del huevo encima de la alantois usando un disector de duramadre.
Usando pinzas de disección, agarre con cuidado el borde de la pared del cuerpo y tire de él ligeramente hacia el espectador para hacer visible la abertura al celio. Mueva suavemente el organoide hacia y a través de la abertura en la pared del cuerpo hacia el celum con un alambre de tungsteno romo y un soporte de micro bisturí. Empuje el organoide ligeramente cranealmente para alojarlo dentro del celio.
Ahora es visible justo detrás del brote del ala. Agregue tres gotas de DPBS al huevo usando una pipeta de transferencia de plástico. Selle cuidadosamente la ventana con un trozo grande de cinta transparente antes de volver a colocar el huevo en la incubadora hasta el día 12 de incubación.
Corte la cinta de la ventana con tijeras curvas de disección. Coloque el huevo bajo un microscopio de disección en un soporte de goma. Evalúe la vasculatura y localice las venas, que se pueden distinguir de las arterias por su color rojo ligeramente más brillante.
Para mejorar el acceso a la vasculatura, amplíe cuidadosamente la ventana cortándola con tijeras de disección curvas. Después de seleccionar la vena, inserte la punta de la aguja microcapilar en la vena en un ángulo de cero a 20 grados. Asegúrese de que la aguja esté en la vena moviendo suavemente la punta de lado a lado.
Sople suave y constantemente en el sistema de inyección para inyectar la aglutinina culinaris del cristalino. Y coloque el huevo de nuevo en la incubadora durante 10 minutos para que circule. Coloque el huevo en un soporte de goma en el banco.
Luego, corte a través de las membranas que rodean el embrión con tijeras de disección curvas. Recoge el embrión del huevo con una cuchara perforada e inmediatamente decapita el embrión con unas tijeras. Bajo el microscopio de disección, coloque el cuerpo del embrión en una placa de Petri.
Coloque el embrión boca arriba en la placa de Petri y extienda sus extremidades. Abra cuidadosamente la pared abdominal del embrión a lo largo del eje longitudinal con fórceps. Localiza el organoide dentro del embrión.
El organoide se adhiere con mayor frecuencia al lóbulo hepático derecho, ya sea en la punta del mimo o cranealmente, justo debajo de la caja torácica. Por lo tanto, es recomendable comenzar mirando estas ubicaciones. Una vez localizado el organoide, retíralo del embrión cortándolo alrededor con micro tijeras.
Coloque el organoide en el tejido de pollo que inevitablemente está unido a él en una placa de Petri bajo el microscopio de disección. Retire la mayor cantidad posible de papel de pollo con una cuchilla de afeitar de acero inoxidable de doble filo. Las imágenes inmunofluorescentes de un organoide renal no trasplantado y un organoide renal trasplantado contienen estructuras glomerulares y tubulares.
En los organoides no trasplantados, algunas células endoteliales humanas están presentes. En el organoide trasplantado, una red vascular perfundida es visible en todo el organoide. Las imágenes ampliadas de las áreas en caja demuestran los tres tipos de células endoteliales que se pueden distinguir en los organoides trasplantados: células endoteliales humanas perfundidas, células endoteliales humanas no perfundidas y células endoteliales derivadas de pollo perfundidas.
En los organoides no trasplantados, las células endoteliales rodean las estructuras glomerulares pero no las invaden. Sin embargo, en los organoides trasplantados, las estructuras glomerulares están vascularizadas por capilares perfundidos. Los organoides trasplantados se pueden analizar utilizando diferentes técnicas dependiendo del objetivo del experimento.
La comparación directa con los controles no trasplantados puede proporcionar información sobre el proceso de vascularización y maduración.
