Este método permite el estudio sistemático de la influencia del tamaño de poro y la velocidad de flujo en el desarrollo de biopelículas en medios porosos naturales y artificiales, por lo que se puede desentrañar el mecanismo fundamental de la bioobstrucción de medios porosos. Las principales ventajas de las técnicas son la mayor resolución espacial y temporal de la alteración, y la adaptabilidad de la plataforma a una gama de condiciones y requisitos experimentales. Comience encendiendo la incubadora de cajas del microscopio tres horas antes del experimento para garantizar una temperatura estable de 25 grados centígrados.
Conecte el tubo de entrada y salida al dispositivo microfluídico. Asegure la conexión entre el tubo y la jeringa insertando una aguja con un diámetro exterior de 0,6 milímetros en el tubo de entrada. Coloque el dispositivo microfluídico, 30 mililitros de agua desionizada y 30 mililitros de medio de cultivo en un desecador al vacío y desgasifique durante al menos una hora.
Una vez hecho esto, tire lentamente del medio de cultivo y del agua desionizada en dos jeringas separadas de 30 mililitros. Luego, monte el dispositivo microfluídico en el microscopio y coloque el tubo de salida en un contenedor de desechos. Conecte la jeringa llena de agua desionizada al canal microfluídico a través del tubo microfluídico e inyecte lentamente el agua hasta que salga de la salida del sensor de presión.
Llene el sensor de presión con agua y enjuague todas las burbujas del tubo que conecta el canal microfluídico y el sensor de presión. Cierre la salida del sensor de presión con los tornillos dedicados al sensor de presión. Llene el resto del canal microfluídico con agua desionizada.
A continuación, coloque un filtro de 1,2 micrómetros en la jeringa del medio de cultivo. Retire la jeringa de agua y conecte con cuidado la jeringa al tubo microfluídico de entrada. Después de montar la jeringa en la bomba de la jeringa, enjuague el canal con el medio de cultivo a un caudal de dos mililitros por hora durante una hora.
A partir de entonces, ajuste la bomba de jeringa al caudal deseado durante el experimento y ajuste la lectura de presión de los sensores de presión a cero. A continuación, pipetear un mililitro del cultivo Bacillus subtilis NCIB 3610 de una densidad óptica de 0,1 a una longitud de onda de 600 nanómetros en un vial de centrífuga de 1,5 mililitros. Para cargar el cultivo bacteriano en el canal microfluídico, coloque el tubo de salida en el vial de la centrífuga y espere cinco minutos para eliminar cualquier burbuja de aire potencial de la salida del tubo.
Una vez hecho esto, retire 150 microlitros de solución bacteriana a una velocidad de flujo de un mililitro por hora hasta que el canal microfluídico se llene con el cultivo bacteriano. Luego, retire con cuidado el filtro de la jeringa de los medios de cultivo y coloque la salida en el contenedor de residuos. Deje las células bacterianas en condiciones de flujo cero en el canal microfluídico durante tres horas para permitir su fijación superficial en el medio poroso.
Para comenzar el experimento, inicie el flujo ajustando la bomba de jeringa al caudal deseado y comience la lectura de presión a un hertz antes de adquirir las imágenes de las biopelículas en crecimiento en el intervalo de tiempo deseado, la configuración óptica y el aumento. El proceso de formación de biopelícula se visualizó utilizando microscopía de campo brillante, donde las células bacterianas y la biopelícula aparecieron en las imágenes como píxeles más oscuros. Durante un experimento de 24 horas, la biopelícula inicialmente de crecimiento aleatorio colonizó casi todo el medio poroso.
La cobertura superficial de la biopelícula se produjo un 10% más rápido en el tamaño de poro más pequeño que en el tamaño de poro más grande a las 20 horas. La correlación de la cobertura superficial de la biopelícula con la acumulación de presión mostró que la obstrucción en el canal microfluídico de menor tamaño de poro condujo a una mayor diferencia de presión entre la entrada y la salida que en el tamaño de poro más grande. Los aspectos más importantes a recordar son ejecutar el experimento en un entorno de temperatura estable y desgasificar bien el dispositivo microfluídico y las soluciones para evitar la formación de burbujas.
Este método permite estudios sistemáticos para desentrañar los mecanismos fundamentales del crecimiento de biopelículas en medios porosos industriales y naturales con respecto a la influencia del caudal y el tamaño de poro.
