Nuestro protocolo proporciona un método suave de inoculación y extracción de plantas que permite recuperar poblaciones bacterianas cultivadas en el apoplasto foliar adecuado para el análisis de expresión génica unicelular, como la citometría de flujo. Este método permite la extracción de una cantidad considerable de bacterias del apoplast sin contaminar significativamente las muestras con restos celulares vegetales. Este método optimizado para la recuperación de bacterias apoplásicas se puede aplicar directamente o con modificaciones menores a una serie de sistemas bacterianos de plantas que comprenden bacterias patógenas de plantas o bacterias endocíticas beneficiosas.
Demostrando el procedimiento estará Nieves López-Pagán, estudiante de doctorado de nuestro laboratorio. Para comenzar, llene una maceta de 10 centímetros de diámetro con una mezcla de sustrato vegetal de vermiculita 1: 3 previamente regada. Cubra la maceta con una malla metálica perforada y ajuste la malla metálica al suelo húmedo con una banda elástica.
A continuación, siembre semillas de Arabidopsis en los orificios de la malla metálica con un palillo de dientes húmedo. Coloque de tres a cuatro semillas en posiciones distantes dentro de la maceta. Cubra la olla con una cúpula de plástico para mantener alta humedad relativa e incube para la estratificación a cuatro grados centígrados durante 72 horas.
Transfiera la maceta a una cámara de crecimiento de plantas en condiciones de días cortos. Para destapar la olla, retire la cúpula de plástico. Una vez germinadas las semillas, usa las pinzas para retirar la mayoría de las plántulas, manteniendo una plántula en cada una de las posiciones de la maceta.
Luego prepare las plantas de frijol Phaseolus vulgaris cubriendo el fondo de una placa de Petri con un trozo de toalla de papel húmeda y colocando las semillas de frijol encima. Selle la placa de Petri con cinta quirúrgica e incube a 28 grados centígrados durante tres o cuatro días. Transfiera las semillas germinadas a una maceta de 10 centímetros de diámetro llena con una mezcla húmeda de sustrato vegetal de vermiculita 1: 3 e incube en una cámara de crecimiento de plantas en entornos de día largo.
Extraiga el stock de glicerol de la cepa de siringas de Pseudomonas de interés de menos 80 grados centígrados en una placa LB suplementada con los antibióticos apropiados. Incubar la placa a 28 grados centígrados durante 40 a 48 horas. Raspa la biomasa bacteriana y resuspendela en cinco mililitros de cloruro de magnesio de 10 milimolares.
Mida la densidad óptica a 600 nanómetros y ajústela a 0.1 agregando cloruro de magnesio de 10 milimolares. Realice diluciones seriadas en cloruro de magnesio 10 milimolares para obtener una concentración final de inóculo de cinco veces 10 a la quinta UFC por mililitro. Luego, prepare 200 mililitros de inóculo para las plantas de Arabidopsis y 50 mililitros para las plantas de frijol.
Antes de la inoculación, añadir el tensioactivo Silwet L-77 a una concentración final de 0,02% para la inoculación de frijol y 0,01% para Arabidopsis. Para la infiltración de Arabidopsis, coloque dos palos de madera formando una X sobre la olla y coloque la olla boca abajo sobre una placa de Petri de 14 centímetros de diámetro que contiene 200 mililitros de inóculo. Para la inoculación de hojas de frijol, inserte las plantas y la solución de inóculo en una cámara de vacío e introduzca la hoja en un tubo de centrífuga cónica de 50 mililitros que contiene el inóculo.
Dar un pulso de 500 milibares durante 30 segundos para infiltrarse en las hojas. Escurrir el exceso de solución de inóculo con un trozo de papel y devolver los planos a su cámara de crecimiento correspondiente. Cuatro días después de la inoculación, corte la parte aérea de la planta Arabidopsis o la hoja inoculada de la planta de frijol y colóquela en una jeringa de 20 mililitros sin aguja.
Para las hojas de frijol, enrolle la hoja sobre sí misma, dejando la cara abaxial hacia afuera. Agregue suficiente volumen de agua destilada para cubrir el tejido. Luego, inserte el émbolo que sostiene la jeringa en posición vertical y retire el exceso de aire y las burbujas de aire dentro de la jeringa golpeando suavemente el barril hasta que todo el aire esté ubicado cerca de la punta y, después de retirar el aire, cubra la punta del cilindro de la jeringa con una película de parafina.
Ahora presione cuidadosamente el émbolo para generar presión positiva hasta que el tejido se oscurezca. Luego, tire del émbolo para generar presión negativa. Retire la película de parafina y el émbolo y recoja el líquido que contiene las bacterias extraídas por el apoplasto.
Para un análisis de una sola célula, prepare una solución de agarosa al 1,5% en agua destilada. Una vez fundido, agregue suficiente volumen para llenar el espacio entre dos portaobjetos de microscopía colocados uno al lado del otro y coloque otro portaobjetos encima. Déjelos conducir durante 15 minutos y retire el tobogán colocado en la parte superior con cuidado.
Con una cuchilla, corte la almohadilla de agarosa en trozos de cinco milímetros por cinco milímetros antes de usarlos. Paralelamente, centrifugar un milímetro de las bacterias extraídas por el apoplasto. Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta y vuelva a suspender el pellet en 20 microlitros de agua para concentrar las células.
Coloque una gota de dos microlitros de las células concentradas en un cubreobjetos de 0,17 milímetros y cubra la gota con un trozo de almohadilla de agarosa. Visualice la preparación bacteriana bajo el microscopio confocal para identificar bacterias fluorescentes verdes utilizando láseres específicos. Identifique todas las bacterias usando el campo brillante y combine ambos campos.
Para realizar el análisis por citometría de flujo, tome una alícuota de las suspensiones de bacterias extraídas con apoplastos. Analice usando el citómetro de flujo y adquiera 100, 000 eventos. La expresión de hrpL GFP es monitoreada por fluorescencia GFP.
Los gráficos de diagramas de puntos muestran la distribución de la intensidad de fluorescencia de GFP versus el tamaño celular en la población, mientras que los histogramas muestran la intensidad de fluorescencia de GFP versus recuentos celulares. Los porcentajes de hrpL ON fueron más altos que los porcentajes correspondientes de hrpL OFF. Las imágenes de microscopía de fluorescencia muestran niveles heterogéneos de GFP asociados con la expresión de hrpL.
Se observan bacterias que muestran baja o ninguna fluorescencia GFP. Para obtener resultados óptimos, sea suave durante los pasos de extracción de bacterias para evitar dañar el tejido vegetal y así limitar la contaminación del contenido celular de la planta. Las muestras de bacterias obtenidas se pueden utilizar para otros fines en los que la reducción de la contaminación de las plantas es una ventaja, como las extracciones de ácidos nucleicos para su posterior análisis genómico o transcriptómico bacteriano.
