丁香假单胞菌基因在植物组织中表达的单细胞分析

我们的方案提供了一种温和的植物接种和提取方法，可以恢复在叶质体中生长的细菌种群，适用于单细胞基因表达分析，如流式细胞术。该方法允许从质外体中提取大量细菌，而不会用植物细胞碎片显着污染样品。这种优化的质外体细菌回收方法可以直接应用于或对包括植物致病菌或有益内吞菌在内的许多植物细菌系统进行微小修改。

演示该程序的将是来自我们实验室的博士生Nieves Lopez-Pagan。首先，用先前浇水的 1:3 蛭石植物基质混合物填充一个 10 厘米直径的花盆。用穿孔金属网盖住锅，并使用橡皮筋将金属网调整到潮湿的土壤上。

接下来，用湿牙签将拟南芥种子播种到金属网的孔中。将三到四颗种子放在花盆内远处的位置。用塑料圆顶盖住锅以保持较高的相对湿度，并在 4 摄氏度下孵育分层 72 小时。

在短日照条件下将花盆转移到植物生长室中。要揭开锅盖，请取下塑料圆顶。种子发芽后，用镊子去除大部分幼苗，在花盆的每个位置保留一棵幼苗。

然后用湿纸巾覆盖培养皿的底部并将豆子种子放在上面来准备菜豆植物。用手术胶带密封培养皿，并在28摄氏度下孵育三到四天。将发芽的种子转移到装有湿的1:3蛭石植物基质混合物的10厘米直径的花盆中，并在长时间设置的植物生长室中孵育。

将目标丁香假单胞菌菌株的甘油原液从零下 80 摄氏度划出到补充有适当抗生素的 LB 平板中。将板在 28 摄氏度下孵育 40 至 48 小时。刮擦细菌生物质并将其重悬于五毫升10毫摩尔氯化镁中。

测量600纳米处的光密度，并通过添加10毫摩尔氯化镁将其调节至0.1。在 10 毫摩尔氯化镁中进行连续稀释，以获得每毫升 10 至 5 CFU 的最终接种浓度的五倍。然后，为拟南芥植物准备200毫升接种物，为豆类植物准备50毫升接种物。

接种前，加入表面活性剂Silwet L-77至豆类接种终浓度为0.02%，拟南芥终浓度为0.01%。对于拟南芥浸润，将两根形成X形的木棍放在锅上，并将锅朝下放在直径14厘米的培养皿上，培养皿中含有200毫升接种物。对于豆叶接种，将植物和接种液插入真空室，并将叶子引入含有接种物的50毫升锥形离心管中。

给予 500 毫巴的脉冲 30 秒以渗透叶子。用一张纸排出多余的接种液，然后将计划放回相应的生长室。接种后四天，切下拟南芥植物的地上部分或豆类植物的接种叶，并将其放入20毫升注射器中，无需针头。

对于豆叶，将叶子自己卷起来，让远轴面朝外。加入足够体积的蒸馏水以覆盖组织。然后，将固定注射器的柱塞插入直立位置，并通过轻轻敲击注射器直到所有空气都位于尖端附近来去除注射器内部多余的空气和气泡，并在取出空气后，用石蜡膜覆盖注射器筒的尖端。

现在小心地按压柱塞以产生正压，直到组织变黑。然后，拉动柱塞以产生负压。取出石蜡膜和柱塞，收集含有质外体提取细菌的液体。

对于单细胞分析，在蒸馏水中制备1.5%琼脂糖溶液。融化后，添加足够的体积以填充并排放置的两个显微镜载玻片之间的空间，并将另一张载玻片放在顶部。让他们开车 15 分钟，然后小心地取下放在顶部的滑梯。

使用刀片，在使用前将琼脂糖垫切成五毫米乘五毫米的碎片。同时，离心一毫米的质外体提取的细菌。使用移液管小心地除去上清液，并将沉淀重悬于20微升水中以浓缩细胞。

将两微升浓缩细胞滴在0.17毫米盖玻片上，并用一块琼脂糖垫覆盖液滴。在共聚焦显微镜下可视化细菌制备，以使用特定激光识别绿色荧光细菌。使用明场识别所有细菌并合并两个场。

要通过流式细胞术进行分析，请等分试样提取的质外体提取的细菌悬浮液。使用流式细胞仪进行分析并获取 100， 000 个事件。通过GFP荧光监测hrpL GFP的表达。

点阵图显示了GFP与细胞大小在群体中的荧光强度分布，而直方图显示了GFP的荧光强度与细胞计数的关系。hrpL ON百分比高于相应的hrpL OFF百分比。 荧光显微镜图像显示与hrpL表达相关的GFP的异质水平。

观察到显示低或没有GFP荧光的细菌。为了获得最佳效果，在细菌提取步骤中要温和，以避免损坏植物组织，从而限制植物细胞含量的污染。获得的细菌样品可用于减少植物污染具有优势的其他目的，例如用于后续细菌基因组或转录组学分析的核酸提取。