Extracción de Lumican de la membrana amniótica y determinación de su temperatura de almacenamiento

Este método tiene como objetivo demostrar una técnica sencilla para la extracción de proteínas, útil para la obtención de proteínas abundantes y otros factores. Esta técnica podría utilizarse para extraer otros factores y proteínas presentes en la membrana amniótica y también, para obtener proteínas de otras fuentes como animales y tejidos vegetales. Comience descongelando 100 miligramos de la membrana amniótica obtenida del banco de amnios.

Una vez descongelada, agregue 10 mililitros de la solución salina equilibrada estéril a una placa de Petri y lave la membrana durante dos minutos. Luego, retire la solución salina balanceada utilizada en un vaso de precipitados y repita el proceso hasta que no haya rastro de medio de glicerol visible en la placa de Petri. A continuación, agregue 10 mililitros de dispasa II a la membrana e incube a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 30 minutos.

Al final de la incubación, realice una desepitelización mecánica con un raspador de células de policía de goma. Luego, visualice la membrana bajo un microscopio invertido para confirmar la desepitelización. A continuación, lave la membrana amniótica desepitelizada con la solución salina equilibrada estéril como se demostró anteriormente, y colóquela en un tubo de microcentrífuga de dos mililitros.

Luego, sumerja el tubo que contiene la membrana en nitrógeno líquido durante 40 minutos. Después de la congelación con nitrógeno líquido, muele manualmente la membrana durante dos o tres minutos en un mortero, preenfriado a menos 85 grados centígrados, hasta que se obtenga un polvo fino. A continuación, agregue 2,5 mililitros de solución inhibidora de la proteasa y solubilice la membrana finamente pulverizada.

Limpie las paredes de mortero con la ayuda de un cuchillo de bisturí y transfiera la mezcla a un tubo de cinco mililitros. Vórtice el tubo durante 30 segundos. Luego, homogeneice la mezcla de tejido centrifugando primero a 34 G durante 20 minutos a cuatro grados centígrados, e inmediatamente centrifugando nuevamente a 3, 360 G durante 20 minutos a cuatro grados centígrados.

Al final de la centrifugación, recoja el sobrenadante, que es el extracto de membrana amniótica, en un tubo nuevo. Luego, alícuota 0.7 mililitros en un tubo de microcentrífuga diferente de dos mililitros para varios puntos de tiempo y temperaturas. La cantidad total de proteína y la concentración de lumicano en el extracto de membrana amniótica se vieron afectadas por el tiempo y las condiciones de almacenamiento.

La concentración de proteína basal fue similar entre todos los extractos de membrana amniótica. Sin embargo, se observó una concentración de proteína significativamente alta en el extracto almacenado durante 32 días a cuatro grados centígrados y 20 días a menos 20 grados centígrados. Lumican en el extracto de membrana amniótica fue significativamente mayor en la muestra almacenada durante un período de 12 días en comparación con las muestras almacenadas durante 30, 20 y seis días a cuatro y menos 20 grados centígrados.

Estos resultados sugirieron que el tiempo de almacenamiento y la temperatura adecuados para lograr la mayor concentración de lumicano es de 12 días a menos 20 grados centígrados. Ejerza el máximo cuidado mientras conecta a tierra la membrana amniótica congelada. La conexión a tierra debe ser suave, ya que podría caerse del mortero.

Se necesitan estudios adicionales para determinar el papel del extracto de membrana amniótica lumican en las células epiteliales corneales y para determinar la dosis ideal de lumican para la reepitelización corneal.