Nuestro modelo in vitro de músculo cardíaco humano tridimensional derivado de células madre mejora la biofidelidad del cultivo celular bidimensional tradicional al tiempo que elimina las diferencias entre especies asociadas con las pruebas con animales de laboratorio. Nuestro diseño de biorreactor multitejido con rastreadores de postes estables maximiza el éxito de los tejidos y mejora la precisión de la caracterización en profundidad de la función tisular cardíaca diseñada. Dado que la insuficiencia cardíaca sigue siendo la principal causa de muerte en todo el mundo, nuestros tejidos cardíacos diseñados permiten a los investigadores modelar enfermedades cardíacas humanas, así como detectar posibles terapias.
Para comenzar, coloque cuatro moldes maestros negativos de aluminio en el soporte de fundición de modo que los orificios del poste se alineen con el espacio muerto opuesto a los estantes triangulares. Coloque el aparato entre dos soportes paralelos y sujete los lados con una pieza rectangular de lámina de silicona de 0,5 milímetros de espesor como junta para evitar fugas del PDMS líquido. En un recipiente poco profundo, mezcle 0,5 mililitros de agente de curado PDMS con cinco mililitros de base de elastómero PDMS en una proporción de uno a 10 y revuelva vigorosamente durante cinco minutos.
Desgasificar la mezcla de PDMS en una cámara de vacío bajo un fuerte vacío hasta que desaparezcan las burbujas. A continuación, vierta la mezcla de PDMS en el aparato de fundición, llenando en exceso para garantizar una cobertura completa de cada ranura. Agregue pequeñas cuentas de vidrio de colores al cuerpo de los bastidores PDMS opuestos al lado con los postes para la identificación única de cada estante.
Coloque el aparato de fundición nivelado horizontalmente en la cámara de vacío bajo un fuerte vacío durante al menos 12 horas. Deje que el PDMS se cure a temperatura ambiente lejos del polvo durante 48 horas para permitir un curado completo y la máxima resistencia de los postes delicados. Retire la abrazadera, los soportes y las láminas de silicona del aparato de fundición.
Con una cuchilla de afeitar de acero inoxidable, recorte la película PDMS en la parte superior del aparato de fundición y los soportes del marco. Use los dedos para separar los bastidores PDMS de los lados del soporte de fundición. Inserte una hoja de afeitar de acero inoxidable desafilada en el espacio muerto entre el yeso y el soporte de yeso y sepárelos, asegurándose de que el PDMS que llena el espacio muerto permanezca con el soporte de yeso.
Luego, con una cuchilla afilada de acero inoxidable, corte las películas PDMS restantes y el PDMS de espacio muerto de las puntas de los postes. Con los dedos, separe lentamente la rejilla PDMS del yeso en el lado opuesto a los postes. Continúe alternando los lados hasta que los postes estén libres de los moldes maestros.
Libere todos los bastidores PDMS y los postes como se demostró anteriormente, y use una cuchilla de afeitar afilada para recortar cualquier exceso de PDMS restante de los bastidores. Usando una impresora 3D de modelado por deposición fundida termoplástica, imprima los componentes del aparato de fundición de rastreador de poste estable, o SPoT. Garantice un ajuste seguro a presión entre las piezas impresas en 3D y entre los bastidores PDMS y la plantilla de tres puntas.
También confirme que los bastidores PDMS encajan perfectamente con los postes que llegan al fondo de los pozos sin doblarse. Mezcle 0,5 mililitros de PDMS negro de la parte A con 0,5 mililitros de la parte B en un bote de pesaje pequeño o en un recipiente poco profundo hasta que la solución tenga un color uniforme. Desgasificar el PDMS negro mezclado en una cámara de vacío bajo un fuerte vacío durante 20 minutos.
Vierte el PDMS negro desgasificado sobre la base impresa en 3D para rellenar los agujeros y golpea para asegurarte de que no quedan burbujas. Raspe la mayor cantidad posible de PDMS de la base. Encaje la pieza de tres puntas en la base y coloque los bastidores de PDMS en las ranuras de la plantilla de tres puntas, asegurándose de que los extremos de los postes se sumerjan en el PDMS negro de los pozos circulares.
Deje que el PDMS negro se cure a temperatura ambiente lejos del polvo durante 48 horas. Deslice hacia afuera la pieza de tres puntas, minimizando la tensión en los postes. Con unas pinzas pequeñas, raspe la fina película negra de PDMS que rodea cada SPoT, luego inserte unas pinzas dobladas y de punta fina en el pocillo del SPoT para liberarlo de la base impresa en 3D.
Inspeccione los SPoT y recorte cualquier resto de película negra de PDMS del proceso de fundición con unas finas tijeras de vannas. Asegúrese de que los postes terminados tengan la longitud correcta colocando los bastidores PDMS en el marco del teléfono celular de polietileno y luego deslizándolo sobre la placa base negra. Después de esterilizar el biorreactor en autoclave y preparar la mezcla celular, se procede a fabricar los hECT.
Con guantes estériles, retire la placa base negra de la bolsa esterilizada en autoclave que contiene las piezas del biorreactor y colóquela en un plato de 60 mililitros con los pocillos hacia arriba. Pipetear 44 microlitros de la mezcla de células en cada pocillo lentamente para evitar la introducción de burbujas. Con un par de guantes estériles nuevos, retire el marco de polisulfona con las gradillas PDMS de la bolsa del autoclave.
Baje el marco sobre la placa base de modo que los extremos del marco encajen en las ranuras del extremo de la placa base. Asegurándose de que los postes estén todos rectos y que el marco no esté inclinado, coloque el biorreactor en un plato de 60 milímetros. Agregue un mililitro de FBS al 10% en medio de mantenimiento de cardiomiocitos a la placa de 60 mililitros para aumentar la humedad a medida que los hECT se solidifican.
Coloque el plato sin tapa en un plato de alto perfil de 100 milímetros y cúbralo con una tapa de plato de 100 milímetros, luego regrese el biorreactor a una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados Celsius para permitir que el colágeno forme un gel con las células en suspensión. Después de dos horas, retire el plato de la incubadora. Agregue 13 mililitros de FBS al 10% en el medio de mantenimiento de cardiomiocitos, inclinando el plato para permitir que el medio fluya entre la placa base de PTFE y las gradillas de PDMS.
Inspeccione el biorreactor desde un lado para ver si no hay burbujas de aire y devuelva el plato a la incubadora. Si queda aire atrapado, incline el biorreactor fuera del medio para dejar que la burbuja se rompa y vuelva a bajarlo lentamente, o utilice una micropipeta con una punta de carga de gel para desviar el aire sin alterar los postes. Inspeccione la compactación hECT a través de la ventana del marco.
A lo largo de 24 a 96 horas, los TCE se compactan y se vuelven opacos. Retire la placa base cuando los hECT estén compactados en al menos un 30% en comparación con el diámetro original. Llene el plato de 60 milímetros que contiene el biorreactor con medio de mantenimiento de cardiomiocitos hasta que el líquido se enjuague con el borde del plato y agregue 14 mililitros a un nuevo plato de 60 milímetros.
Mientras usa guantes estériles, voltee el biorreactor en su plato para que la placa base quede en la parte superior. Después de inspeccionar si hay burbujas de aire atrapadas, levante lentamente la placa base, manteniéndola nivelada. Asegúrate de que los consejos de las publicaciones estén enfocados.
Encienda el interruptor de umbral y ajuste el control deslizante hasta que los SPoT estén bien demarcados y no cambien de forma a medida que se contrae la hECT. Use la herramienta de rectángulo para dibujar un rectángulo alrededor de uno de los SPoT y haga clic en el botón establecer uno dentro del cuadro de límites de la publicación para establecer la posición del rectángulo alrededor del SPoT, asegurándose de que el SPoT siempre permanezca dentro del límite del rectángulo. Repita el proceso en la otra publicación y grábelo en el segundo conjunto.
Ajuste la configuración del tamaño del objeto para evitar que el programa realice un seguimiento de los objetos más pequeños y asegúrese de que el número de objetos rastreados en cada rectángulo permanezca constante. La interfaz muestra la distancia medida entre los objetos rastreados en tiempo real. Utilice este gráfico para controlar el ruido.
Debajo del encabezado de hercios de frecuencia de marcapasos, indique el rango de frecuencias deseadas y el intervalo deseado para pasar de mínimo a máximo. En los cuadros de la derecha, elija el tiempo de ajuste deseado para permitir que el hECT se ajuste a la nueva frecuencia de estimulación y, a continuación, especifique el tiempo de grabación y el voltaje de estimulación. Comience el programa haciendo clic en el botón de inicio del programa.
Después de que se hayan grabado los datos de una frecuencia, aumente la frecuencia del estimulador en el intervalo deseado para una nueva grabación hasta que se haya alcanzado la frecuencia máxima. Aquí se muestran imágenes representativas de las TEC vistas desde la parte inferior, creadas sin SPoT y con SPoT. Los SPoT proporcionaron una única forma definida para realizar un seguimiento durante la adquisición de datos.
En algunos casos extremos, el objeto de rastreo incluso se oscureció. Una forma más fiable para el seguimiento óptico y la reducción del ruido permitió la medición de tejidos débiles con una fuerza desarrollada tan baja como un micro Newton. Los SPoT proporcionaron una geometría de tapa que evitó la pérdida de hECT.
La función de TEC medida se mantuvo estable durante el tiempo de cultivo prolongado en la configuración de estimulación actual con la etapa calentada. En comparación con las mediciones a temperatura fisiológica, los TEC mostraron una dinámica de contracción alterada a temperatura ambiente, con tasas más lentas de contracción y relajación. A frecuencias más altas, los TEC tendían a ser más débiles a temperatura ambiente.
A frecuencias más bajas, los TEC tendían a ser más fuertes a temperatura ambiente. Cuando se marcaron a 36 grados centígrados, los hECT tenían una frecuencia de latidos espontáneos más alta y un rango más amplio de frecuencias de captura. El entorno de temperatura controlada garantiza la relevancia fisiológica de la función de las hECT medidas.
Además, el baño de medios compartidos del biorreactor multitejido facilita los estudios de señalización paracrina entre hECTs de diferentes composiciones celulares. La adición de SPoT a nuestro biorreactor multitejido permite a los investigadores estudiar de manera eficiente el miocardio enfermo con una tensión anormalmente alta o baja, que de otro modo se deslizaría por los extremos de los postes destapados.
