Este protocolo desarrolló un método para estimar el rendimiento de compuestos en la placa TLC utilizando la técnica de iluminación azul-LED. Las ventajas de este método son que la técnica de iluminación azul-LED es un método seguro, eficaz y barato, y permite al investigador medir múltiples muestras al mismo tiempo. Este método también se puede aplicar a la bioquímica y la química de productos naturales.
Para comenzar, seque el cultivo a 40 grados centígrados durante 24 horas. Transfiera el cultivo seco a un tubo de 50 mililitros con pinzas esterilizadas y agregue 15 mililitros de acetato de etilo. Agitar la mezcla vigorosamente haciendo vórtice durante un minuto e incubar el tubo durante una hora a 40 grados centígrados con agitación a 200 RPM.
Luego sonicar la mezcla usando un baño ultrasónico de 40 kilohercios a 40 grados centígrados durante una hora. A continuación, centrifugar la mezcla a 5, 000 G durante un minuto a temperatura ambiente y filtrar a través de un papel de filtro de 11 micrómetros. Extraiga el filtrado con un volumen igual de agua estéril en un embudo separador.
Después de la separación de fases, recoja la capa orgánica, evapore en un evaporador rotativo y disuelva el residuo en dos mililitros de acetato de etilo. Empaque la columna con gel de sílice de fase normal como fase estacionaria, y use acetato de etilo de n-hexano y ácido trifluoroacético como fase móvil. Cargue dos mililitros del extracto en la columna y agregue el disolvente de fase móvil a un caudal de un mililitro por minuto para eluyir el extracto.
Después de verificar el efluente por TLC para confirmar la presencia de lovastatina, evaporar en un evaporador rotativo a 45 grados centígrados hasta que se elimine el solvente. Disuelva el residuo en un mililitro de acetato de etilo y luego mezcle con un volumen igual de ácido trifluoroacético al 1%. Centrifugar la mezcla a 5, 000 G durante un minuto a temperatura ambiente y recoger la capa orgánica en un nuevo tubo de vidrio.
Usando una pipeta capilar se señalan cinco microlitros de muestras y patrones de lovastatina en la línea de base de la placa TLC, dejando un borde de un centímetro en los lados de la placa TLC. Luego seque la placa TLC en una campana extractora durante cinco minutos a temperatura ambiente. Coloque la placa suavemente con pinzas en una cámara de vidrio saturado que contenga el disolvente de fase móvil.
Cubra la cámara con una tapa de vidrio y permita que la placa se desarrolle completamente. Retire la placa de la cámara cuando la línea de disolventes alcance un centímetro de la parte superior de la placa. Marque la línea de disolvente con un lápiz y seque la placa en la campana extractora durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Después del secado, remoje inmediatamente la placa en disolvente de ácido sulfúrico al 10% y luego seque en la campana extractora durante 10 minutos a temperatura ambiente. A continuación, coloque la placa en el panel calefactor hasta que aparezcan las manchas marrones. Transfiera la placa al iluminador LED azul y escanee utilizando software gratuito compatible.
Los resultados obtenidos del método de bioensayo demostraron que el cuadrado R entre las dimensiones de la zona de inhibición y los estándares de lovastatina fue de 0,99, y el rendimiento de la muestra fue de 0,56 miligramos según lo predicho por el modelo de regresión. El método de detección UV muestra que el cuadrado R entre los estándares de lovastatina y la dimensión de las bandas en la placa TLC fue de 0,97, y el rendimiento de la muestra predicho por el modelo de regresión fue de 0,53 miligramos. Sin embargo, los bordes de la banda eran borrosos y se observaron bandas de intensidad de señal relativamente bajas.
Para el método de iluminación LED-azul, el cuadrado R entre los estándares de lovastatina y la dimensión de la banda en la placa TLC fue de 0,98, y el rendimiento de la muestra fue de 0,54 miligramos según lo predicho por el modelo de regresión. El rendimiento previsto utilizando el iluminador LED-azul estaba más cerca del método de bioensayo y se obtuvieron bandas claras. Si la placa se sobrecalienta, la visualización de lovastatina puede ser difícil de observar.
