Nuestro protocolo para aislar el mesénquima intestinal da como resultado un alto rendimiento de telocitos. Este método ofrece una plataforma inicial para estudiar la interacción célula-célula que involucra a los telocitos en la homeostasis y la enfermedad. Los telocitos son células únicas sensibles a los protocolos de disociación tisular disponibles.
Por lo tanto, la principal ventaja de esta técnica es el aislamiento del mesénquima, incluidos los telocitos viables enriquecidos. El mesénquima, incluido el teloccito, puede servir como fuente de moléculas de señalización y factores de crecimiento necesarios para el crecimiento organizado ex vivo. Para comenzar, lave el intestino, separado de un ratón sacrificado, en una placa de Petri que contenga PBS frío y estéril.
Coloque el intestino en una placa de Petri. Y usando tijeras de punta de bola, abra el tubo intestinal longitudinalmente y lave las heces. Transfiera el intestino a un nuevo plato que contenga PBS fresco y frío.
Después de lavar el intestino una vez más, corte el intestino delgado en segmentos de un centímetro de largo y transfiéralos a un tubo cónico de 15 mililitros lleno de ocho mililitros de PBS. Agite el tubo manualmente a uno o dos ciclos por segundo durante un minuto. Vierta la solución en una placa de Petri.
Y usando fórceps, transfiera el segmento a un tubo cónico de 50 mililitros lleno de 20 mililitros de Solución A.Coloque los tubos en una incubadora de agitador orbital a 37 grados centígrados durante 20 minutos. Después de la incubación, agite el tubo vigorosamente a mano a cuatro o cinco ciclos por segundo durante un minuto para disociar el epitelio. Repita este paso una vez más.
Después de cortar y lavar los fragmentos como se demostró anteriormente, transfiéralos a un nuevo tubo de 50 mililitros lleno de 10 mililitros de PBS estéril e invierta el tubo a uno o dos ciclos por segundo durante un minuto. Vierta la solución en una placa de Petri. Transfiera los segmentos a un nuevo tubo de 15 mililitros lleno de 10 mililitros de PBS estéril e inclínelos suavemente hacia arriba y hacia abajo a uno o dos ciclos por segundo durante dos minutos.
Debajo de un gabinete de bioseguridad, use fórceps para colocar los segmentos en una toallita de laboratorio estéril para secarlos. Una vez secos, cortar los gajos en trozos. Transfiera las piezas cortadas usando pinzas a una placa de seis pocillos llena con cuatro mililitros de solución de digestión precalentada por pocillo.
Incubar el plato a 37 grados centígrados durante 50 minutos y agitar suavemente el plato manualmente cada 20 minutos. Luego, transfiera las piezas usando una pipeta Pasteur a un tubo cónico de 15 mililitros lleno con cuatro mililitros de DMEM. Agite el tubo manualmente a cuatro o cinco ciclos por segundo durante un minuto para obtener una suspensión de una sola celda.
Filtre la suspensión a través de un colador de 100 micrómetros en un tubo cónico de 50 mililitros. Centrifugar el filtrado a 700 g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante por aspiración y vuelva a suspender el pellet celular en cinco mililitros de 2% FBS/PBS.
Después de centrifugar la suspensión una vez más a 700 g durante cinco minutos, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 12 mililitros de medio de cultivo. Finalmente, siembra la suspensión celular en placas de seis pocillos. Después de la disociación del mesénquima, los telocitos pierden sus características celulares, mostrando una morfología celular redonda, y reflejan un menor número de células positivas para GFP en el primer día en comparación con los días siguientes.
Unos días más tarde, los telocitos exhiben una morfología celular pequeña y estirada con procesos celulares cortos. Después de siete a 10 días de siembra, los telocitos recuperan sus características celulares, mostrando una morfología celular grande y estirada con largos procesos citoplasmáticos. La citometría de flujo revela la composición celular.
En general, el 69% de las células aisladas fueron viables en base a la tinción DAPI. Y de estos, el 60,9% representaba contaminación epitelial y células inmunes y endoteliales. La fracción de telocitos se dispersó por encima de 100k y 70k FSC y SSC, respectivamente, y representó casi el 10% del mesénquima cerrado.
El análisis FACS reveló que el subconjunto de telocitos puede definirse mediante tinción positiva a CD201 y GP38. La inmunotinción de mesénquimas cultivados de un día utilizando estos marcadores mostró expresión de estos marcadores moleculares, a pesar de que las células no exhibían sus características celulares. Este procedimiento da como resultado una suspensión viable de células estromales de una sola célula, que se puede utilizar no solo para el cultivo 2D sino para cualquier otra aplicación, como el cocultivo 3D con organoides o la bioimpresión.
