Nuestro protocolo facilitaría la investigación de estructuras neuronales desde el circuito hasta las escalas de componentes, lo cual es esencial para una mejor comprensión de las funciones cerebrales. Nuestra técnica de limpieza, ScaleSF, ejerce una potente capacidad de limpieza, así como un alto nivel de preservación de tejidos que se requiere para la visualización simultánea de estructuras a gran y pequeña escala. Nuestro protocolo es especialmente efectivo en el cerebro, donde las células neuronales exhiben procesos elaborados, vínculos tremendos y estructuras subcelulares finas especializadas.
Antes de comenzar el experimento, prepare las soluciones Sca/eS como se muestra en esta tabla y cubra las muestras con papel de aluminio. Comience el procedimiento agregando ocho mililitros cada una de las soluciones ScaleS0 y ScaleS4 a dos pocillos separados de una placa de cultivo celular de seis pocillos y precaliente la placa a 37 grados Celsius en una incubadora. Transfiera las rodajas cerebrales a la solución ScaleS0 precalentada con una espátula e incube las rebanadas durante dos horas a 37 grados centígrados en una incubadora de agitación a 90 RPM.
A continuación, transfiera las rodajas cerebrales permeabilizadas en ocho mililitros de PBS menos en una placa de cultivo celular de seis pocillos y lave durante 15 minutos manteniéndolas en un agitador orbital a 40 a 60 RPM. Repita este paso dos veces. Luego, transfiera las rodajas cerebrales en ocho mililitros de solución ScaleS4 precalentada e incube durante ocho a 12 horas a 90 RPM a 37 grados Celsius.
Para la preparación de la cámara, imprima en 3D el marco de la cámara y los adaptadores de etapa del microscopio. Fije el marco de la cámara a una cubierta con un adhesivo sensible a la presión. Preparar 1,5% de agarosa en la solución ScaleS4D25(0).
Mezclar la solución y calentarla en el microondas hasta que la agarosa se disuelva por completo. Luego deje que la solución se enfríe a 37 grados centígrados. Monte la rebanada cerebral despejada en la cubierta inferior de la cámara de imágenes con una espátula.
Retire el exceso de solución de la rebanada limpia con un pañuelo limpio. Agregue el gel ScaleS4 a la rebanada cerebral usando una micropipeta para llenar la cámara de imágenes. Coloque otro cubrebocas en la parte superior con fórceps seguido de un trozo de papel de seda y un portaobjetos de vidrio.
Transfiera la cámara de imágenes a un refrigerador a cuatro grados centígrados. Coloque pesas de metal en el portaobjetos de vidrio y déjelas durante 30 minutos. Después de la incubación, retire el material de la cámara de imágenes y limpie el exceso de gel.
Coloque la cámara de imágenes en una placa de Petri de vidrio de 60 milímetros y fije el borde de la cámara de imágenes en múltiples puntos a la placa con un adhesivo sensible a la presión. Vierta la solución ScaleS4 en el plato y agite suavemente durante una hora a 40 a 60 RPM a 20 a 25 grados centígrados. Sustitúyalo con una solución fresca y elimine las burbujas de aire en la superficie del gel raspando suavemente la superficie con una punta de pipeta.
Monte la cámara de imágenes en una etapa de microscopio. Prepare un microscopio de barrido láser confocal equipado con una lente de objetivo de inmersión múltiple de 2,5 milímetros de distancia de trabajo, aumento de 16x y apertura numérica de 0,60. Encienda todos los equipos de imágenes relevantes, como la estación de trabajo, el microscopio, el escáner, los láseres, la lámpara de mercurio y lance un software de imágenes.
Ajuste el collar de corrección de la lente del objetivo de inmersión múltiple a 1.47. Sumerja la lente del objetivo en la solución y deje que se acerque lentamente a la rebanada. Retire todas las burbujas de aire atrapadas en la punta de la lente del objetivo.
Encuentre regiones de interés en tejidos despejados utilizando epifluorescencia. Para establecer parámetros de adquisición de imágenes, primero, determine la profundidad de bits para la adquisición de imágenes a medida que el tamaño de la imagen aumenta con el bit. A continuación, establezca la longitud de onda de detección de acuerdo con el espectro de emisión.
Establezca la resolución XY, la velocidad de escaneo y el tamaño del agujero de alfiler. También ajuste la potencia del láser, la ganancia del amplificador del detector y el desplazamiento hasta que se obtenga una imagen adecuada. Determine el tamaño del mosaico en función del tamaño del ROI, asegurando que se capture toda la longitud y el ancho del ROI.
Navegue por el tejido en todos los planos y establezca el inicio y los puntos finales de la pila. Establezca el tamaño del paso Z, de acuerdo con la resolución Z deseada. Recopile las imágenes y procéselas utilizando un software de análisis de imágenes.
Usando este protocolo, se logró la limpieza óptica de una rebanada de cerebro de ratón de un milímetro de grosor. La expresión de EGFP en la corteza cerebral de ratones PV-FGL mostró que se preservó la fluorescencia y la integridad estructural de los tejidos. Las aberraciones inducidas por el desajuste del índice de refracción causaron una pérdida notable del brillo de la imagen y la resolución de las neuronas positivas EGFP.
Estas neuronas se visualizaron claramente con el microscopio de barrido láser confocal cuando se ajustó el collar de corrección para que coincidiera con esta solución ScaleS4. La reconstrucción 3D de las neuronas marcadas con EGFP en la corteza somatosensorial primaria del ratón se realizó en una rebanada cerebral de un milímetro de grosor. Se observaron cenadores dendríticos individuales decorados con espinas dendríticas a mayor aumento.
También se observó arborización terminal del axón y boutones axonales en las rodajas. La coincidencia del índice reflectante entre el fluido de imágenes y la lente del objeto es fundamental para la obtención de imágenes 3D en tejidos despejados. Nuestra técnica facilitaría la integración de la estructura neuronal desde el circuito hasta las escalas de componentes, proporcionando información sobre los mecanismos neuronales, la información del procesamiento en el cerebro.
