Comprender cómo se desarrollan los astrocitos y establecer su morfología compleja es esencial para comprender cómo se desarrolla y funciona el cerebro. Este protocolo describe cómo analizar aspectos clave de la morfología de los astrocitos en el tejido cerebral. Este protocolo utiliza un código personalizado para medir el volumen del territorio de los astrocitos en secciones de tejido grueso.
Esta estrategia también se puede aplicar para medir la cantidad de superposición de territorio entre los astrocitos vecinos. Al combinar este protocolo con la manipulación genética de astrocitos, los investigadores pueden investigar directamente el papel de proteínas y vías específicas en el desarrollo de astrocitos y la interacción astrocito-astrocito Para comenzar, prepare una solución fresca de TBST agregando 1 mililitro de 10% Tritón X a un tubo de 50 mililitros y llenando el tubo a 50 mililitros con TBS. Prepare 2 mililitros de soluciones de bloqueo y anticuerpos para cada cerebro combinando suero de cabra y TBST en un Tubo de 15 mililitros.
A continuación, etiquete una placa de 24 pocillos para colocar diferentes muestras en diferentes filas en diferentes soluciones en diferentes columnas, luego agregue un mililitro de TBST a las primeras tres columnas etiquetadas como lavado 1, lave 2 y lave 3, y agregue 1 mililitro de solución de bloqueo a la cuarta columna. Prepare una selección de vidrio derritiendo el extremo de una pipeta Pasteur de 5.75 pulgadas en un gancho pequeño con un quemador Bunsen, luego transfiera secciones de tejido de la placa de 12 pocillos a la columna de lavado 1 de la placa de 24 pocillos con la púa, luego lave las secciones durante 10 minutos cada una en el lavado 1, 2, y 3 pocillos utilizando la púa de vidrio para transferir las secciones de un pozo a otro, seguido de incubar las secciones durante una hora en la solución de bloqueo. Prepare q mililitro de solución de anticuerpo primario agregando el anticuerpo a la solución de anticuerpos, luego vórtice brevemente y centrífuga durante 5 minutos a mayor o igual a 4, 000 veces g a 4 grados Celsius.
A continuación, incube las secciones en el anticuerpo primario durante 2 a 3 noches a 4 grados centígrados mientras tiembla. Después de la incubación primaria de anticuerpos, aspire el TBST del día 1 de los pozos de lavado, luego agregue 1 mililitro de TBST nuevo a cada pozo de lavado y mueva las secciones al primer pozo de lavado. A continuación, incubar secciones en anticuerpos secundarios durante 3 horas a temperatura ambiente.
Después de la incubación secundaria de anticuerpos, aspire el TBST del día 2 de los pozos de lavado, luego agregue 1 mililitro de TBST nuevo a cada pozo de lavado y mueva las secciones al primer pozo de lavado. Durante el lavado final, saque el medio de montaje de 4 grados centígrados y deje que se caliente a temperatura ambiente, luego prepare una mezcla 2 a 1 de TBS y agua desionizada y agréguelo a una placa de Petri. A continuación, prepare un portaobjetos de microscopio agregando 800 microlitros de mezcla 2 a 1 de TBS y agua desionizada a la superficie.
Transfiera las secciones del pozo de lavado 3 a la placa de Petri, luego use un pincel fino, transfiera las secciones una a la vez desde la placa de Petri al líquido en la diapositiva. A continuación, organice cuidadosamente las secciones para que queden planas en la diapositiva con el pincel. Con cuidado, retire el exceso de líquido de la corredera con una pipeta P-1000, seguida de aspiración al vacío.
Una vez que se haya eliminado todo el exceso de líquido de la corredera, use una pipeta de transferencia para agregar inmediatamente 1 gota de soporte de montaje a cada sección y coloque suavemente un deslizamiento de cubierta sobre la diapositiva. Deje que el medio de montaje se extienda durante unos minutos y luego retire cualquier exceso de soporte de montaje que salga de debajo del deslizamiento de la cubierta por aspiración al vacío. Después, selle los cuatro bordes de la cubierta deslizante con esmalte de uñas transparente.
Deje que los toboganes se sequen durante 30 minutos a temperatura ambiente y luego guárdelos planos a 4 grados centígrados. Usando un objetivo 10x, localice células individuales para obtener imágenes y anote la región o subregión específica del cerebro relevante para el experimento, luego use la perilla de enfoque, determine si todo el astrocito está contenido dentro de la sección. Después, cambie a un objetivo de aceite de aumento más alto y enfoque la célula.
Mientras mira a través del ocular, use la perilla de enfoque para moverse de la parte superior a la inferior de la celda, luego inspeccione visualmente la celda para asegurarse de que toda la celda esté contenida dentro de la sección. Utilizando el software de adquisición asociado a los microscopios confocales, ajuste los parámetros de adquisición para obtener una relación señal-ruido y un nivel de detalle adecuados, luego use un zoom 2x para un objetivo de 40x y ningún zoom si usa un objetivo de 60x o 63x. Establezca los límites superior e inferior de la pila Z con un tamaño de paso de 0,5 micrómetros, lo que garantiza que todo el astrocito se capture con la primera y la última imagen sin ningún etiquetado fluorescente de la célula.
Antes de comenzar el análisis, instale el archivo de extensión de casco convexo, XtspotsConvexHull, pegando el archivo en la subcarpeta rtmatlab de la carpeta XT. Con Imaris File Converter, convierta imágenes a formato IMS. A continuación, abra un archivo de imagen en el software de análisis de imágenes y seleccione el botón Vista 3D para ver la imagen en el modo 3D, asegurándose de que la celda cumpla con los criterios de inclusión.
Para crear una superficie, haga clic en el icono azul Agregar nuevas superficies y, a continuación, cree una región de interés alrededor de la celda introduciendo cotas en los cuadros bajo tamaño de la herramienta de creación de superficies o arrastrando los bordes del cuadro amarillo. A continuación, ajuste la intensidad absoluta del umbral arrastrando la barra amarilla o introduciendo valores en el cuadro para que la superficie gris llene la mayor cantidad posible de la señal de celda sin ir más allá del límite de la celda. Después, haga clic en la flecha verde para terminar de generar la superficie.
Inspeccione cuidadosamente la superficie recién generada y elimine cualquier pieza de superficie que no forme parte de la celda seleccionándolas y, a continuación, haciendo clic en la herramienta Edición de lápiz seguida de la opción Eliminar. Para unificar las piezas de superficie restantes, haga clic en el icono Filtro de embudo para seleccionar todo, luego haga clic en el icono Edición de lápiz y seleccione la opción Unificar. Haga clic en el icono naranja Agregar nuevos puntos y seleccione el canal de origen correcto de la lista desplegable, y luego ingrese un valor estimado de diámetro XY de 0.400 micrómetros en el cuadro.
A continuación, haga clic en la flecha verde para terminar de crear las manchas, luego vuelva a seleccionar las manchas. Haga clic en el icono Filtro y seleccione Distancia más corta a superficies Superficies Superficies X donde superficies X es la superficie que se está analizando en la lista desplegable, lo que garantiza que los botones de encendido umbral inferior y umbral superior estén verdes. A continuación, ingrese una distancia mínima de menos 1.0 micrómetros en el cuadro de umbral inferior y una distancia máxima de 0.1 micrómetros en el cuadro de umbral superior, luego haga clic en el botón Duplicar sección a nuevos puntos, asegurándose de que los puntos recién creados estén seleccionados en el panel superior izquierdo de la ventana del software.
Después, haga clic en el icono Herramientas de engranajes y, a continuación, haga clic en el complemento Convex Hull solo una vez y espere a que aparezca la ventana de MATLAB y luego desaparezca, lo que dará como resultado un casco sólido en la vista 3D. En el panel superior izquierdo, asegúrese de que el casco convexo de spots X Selection, la distancia más corta donde Spots X Selection es el spots recién creado esté seleccionado y luego haga clic en el casco para seleccionarlo. A continuación, haga clic en el icono Estadísticas del gráfico.
En la pestaña Selección, asegúrese de que Valores específicos esté seleccionado en la lista desplegable superior y, a continuación, elija Volumen en la lista desplegable inferior, luego registre el volumen del casco y guarde el archivo, pasando a la siguiente imagen. El volumen del territorio de astrocitos se midió en astrocitos que expresan una proteína fluorescente roja dirigida a la membrana. El derribo de la molécula de adhesión celular enriquecida con astrocitos, hepaCAM, reduce significativamente el volumen del territorio de los astrocitos.
El análisis de mosaico con marcadores dobles se utilizó para generar ratones donde los astrocitos de tipo salvaje expresan una proteína fluorescente roja y los astrocitos knockout hepaCam expresan una proteína fluorescente verde. Se calculó el porcentaje de superposición de territorio entre los pares de astrocitos de proteínas fluorescentes rojas y verdes vecinas. Los ratones con modificación genética de hepaCAM y astrocitos verdes mostraron un porcentaje significativamente mayor de volumen de superposición de territorio con sus vecinos rojos de tipo salvaje en comparación con los pares de astrocitos de tipo salvaje.
Este resultado demuestra que hepaCAM es necesario para el volumen normal del territorio de astrocitos y el mosaico de astrocitos. Es fundamental asegurarse de que la célula cumple con los criterios de inclusión. Una célula incompleta tendrá un volumen de territorio más pequeño y puede afectar sus resultados y conclusiones generales.
