Este protocolo describirá una manera fácil y eficiente de aislar con éxito las células primarias del epitelio pigmentado de la retina del ratón. Las células del epitelio pigmentado de la retina juegan un papel muy importante para mantener las células fotorreceptoras y para garantizar la función normal de la retina. Nuestro laboratorio ha estado aislando células primarias pigmentadas de epitelio de ratón como una herramienta importante para estudiar la barrera hemato-retiniana externa y enfermedades relacionadas, como la degeneración macular relacionada con la edad.
Para extraer los ojos del ratón, eutanasia ética al ratón de acuerdo con los métodos aprobados por su institución, luego coloque el ratón en una almohadilla inferior estéril y nuclee el ojo presionando una pinza estilo 5/45 en el área orbital para inducir proptosis, luego mueva la pinza a la parte posterior del ojo y tire suavemente para extraer el ojo asegurándose de que el nervio óptico aún esté intacto. Mientras usa fórceps, sumerja los ojos en un tubo de microcentrífuga de 2 mililitros que contenga 5% de povidona yodada. Incubar los ojos a temperatura ambiente durante 2 a 3 minutos.
Retire los ojos de la povidona yodada y colóquelos en una placa de Petri. Mientras usa una pipeta de transferencia estéril, lávese los ojos con la solución salina equilibrada de Hanks hasta que el color naranja de la povidona yodada haya desaparecido. Esto requiere aproximadamente de 2 a 3 lavados.
Coloque los ojos en una nueva placa de Petri y sumérjalos en medios fríos de crecimiento celular RPE completo. A partir de ahí, puede comenzar a diseccionar bajo un microscopio de disección. Bajo el microscopio, use pinzas y/o tijeras Vannas para tirar o cortar el tejido conectivo en los músculos extraoculares.
Luego, los ojos se pueden sostener durante una hora en medios de cultivo celular RPE fríos. Sin embargo, es preferible proceder directamente al siguiente paso después de limpiar el globo ocular. Transfiera los ojos a un tubo de microcentrífuga de 2 mililitros que contenga la solución de la enzima A, luego incube los ojos dentro de una incubadora a 37 grados centígrados durante 40 minutos.
Retire los ojos de la solución de enzima A y colóquelos en un nuevo tubo de microcentrífuga de 2 mililitros que contenga la solución de enzima B, luego colóquelos dentro de una incubadora e incube a 37 grados centígrados durante 50 minutos. Retire los ojos de la enzima B y colóquelos en una placa de Petri de 60 milímetros y sumérjalos y complete los medios de crecimiento de células RPE, luego incube los ojos a 4 grados centígrados durante 30 minutos. Coloque el plato bajo el microscopio de disección y comience a diseccionar.
Use fórceps M5S y una aguja de una jeringa para hacer una incisión en la sección de ora serata. Ahora con dos fórceps, agarre la parte interna de la incisión con una pinza y agarre la córnea con la otra pinza. Comience a arrancar lentamente la córnea de la retina tirando de la córnea.
Asegúrese de desgarrar en pequeños incrementos y bajar el desgarro a medida que retira la córnea. Esto asegurará que el RPE permanezca casi intacto y obtendrá una lágrima más limpia. Una vez que la córnea esté completamente separada, debería poder ver el iris y el cristalino.
Retire tanto el iris como el cristalino con fórceps para mantener la pureza del aislamiento. Para extraer la retina neural de la capa RPE, agarre la capa externa del ocular con una pinza y coloque un brazo de una segunda pinza entre las capas RPE y neural. A partir de ahí, tire suavemente o saque la retina neural de la capa RPE, luego deseche la retina neural.
Mueva la capa de RPE a un lugar diferente en el plato libre de residuos. Para separar el EPR de la coroides y la esclerótica, raspe suavemente el interior del ocular con una pinza estilo 5/45 para asegurar la separación de las células del EPR. Las células del EPR aparecen turbias cuando están suspendidas y completan los medios de crecimiento de las células del EPR.
Aspirar las células con una pipeta de transferencia estéril de 3,2 mililitros y transferirlas a un nuevo tubo de centrífuga de 15 mililitros que contenga medios completos de crecimiento celular del EPR. Las células se pueden centrifugar a 300 g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Luego puede aspirar el sobrenadante y resuspender el gránulo en medios de crecimiento de células RPE calentados.
Coloque las células en una placa de Petri de 100 milímetros e incube a 37 grados centígrados y 5% de CO2. Estas imágenes muestran un aislamiento exitoso en el pasaje 0 y el pasaje 1, que es evidente por la pigmentación de las células del EPR. En el pasaje 4, las células se vuelven menos características y exhiben menos pigmento, muestran una apariencia de huso o se vuelven más robustas con un área de superficie más grande.
Validamos las células del EPR con un marcador específico del EPR, RPE65 y una proteína citoesquelética F-actina. También verificamos la posible contaminación con células de Muller mediante tinción con un marcador específico de células de Muller, la vimentina. Este protocolo es una adaptación simplificada de los protocolos existentes.
El protocolo utiliza materiales y equipos asociados que están disponibles en la mayoría de los laboratorios de investigación, lo que ayudará a aislar las células RPE primarias de ratón de una manera efectiva.
