ADH y FAD son moléculas endógenas que exhiben autofluorescencia en diferentes longitudes de onda de excitación y emisión. Debido a su uso como coenzimas de reacciones metabólicas, la microscopía de autofluorescencia puede evaluar el metabolismo celular. Las imágenes de autofluorescencia de NADH y FAD no requieren etiquetas exógenas y es un método no destructivo con resolución subcelular.
La microscopía de autofluorescencia se puede utilizar en muestras vivas y para estudios de cursos de tiempo. Las imágenes autofluorescentes se pueden aplicar ampliamente a cualquier célula o tejido vivo. Las imágenes autofluorescentes se han utilizado en neuronas, células cancerosas, tumores, in vivo, células madre y células inmunes.
Demostrando el procedimiento estará Linghao Hu, un estudiante graduado del Laboratorio de Imágenes Ópticas Cuantitativas de la Universidad de Texas A&M. Comience el experimento encendiendo todos los componentes del microscopio de fluorescencia multifotón de por vida, incluida la fuente láser y los detectores. Antes de colocar la muestra, encienda la lámpara de campo brillante y asegúrese de que la luz entre en el ocular.
Luego, elija un objetivo para la imagen celular. Si no utiliza un objetivo de aire, aplique una gota del medio de inmersión apropiado sobre el objetivo. Coloque el plato con fondo de vidrio en el soporte de la muestra en el escenario del microscopio.
Luego, centre la muestra con el objetivo utilizando el control de etapa X / Y Asegúrese de que la muestra esté asegurada y no se mueva durante la toma de imágenes. Una vez hecho esto, mire dentro del ocular y mueva el objetivo hacia arriba para enfocarse en las células. Si el microscopio está dentro de un recinto, cierre la puerta de la caja de luz.
A continuación, abra el software de adquisición de imágenes y haga clic en la pestaña Imágenes de fotones múltiples para establecer los parámetros de imágenes de fotones múltiples como se describe en el manuscrito. Ajuste la ganancia del detector al valor óptimo para la imagen de fluorescencia de por vida, o FILM. Luego, cambie el tiempo de permanencia del láser que pasa en cada píxel de la muestra al valor deseado.
Para nicotinamida adenina fosfato dinucleótido, o NADPH, ajuste el láser multifotón a 750 nanómetros. Luego, confirme que el control de potencia para el láser esté configurado en cero para que las celdas no se dañen al abrir el obturador en el láser. Establezca un filtro de emisión a 400 a 500 nanómetros.
Cuando se establezcan los parámetros, comience a crear imágenes de manera enfocada o de visualización en vivo para optimizar la configuración de la imagen. Aumente lentamente la potencia del láser de tres a ocho milivatios mientras se asegura de que las células estén enfocadas. Una vez ajustado, registre la potencia máxima utilizada.
Utilice el ajuste de potencia máxima grabada para la toma de imágenes en otros segmentos de la placa de Petri. Recopile una imagen NADPH-FILM con un tiempo de integración de imagen de 60 segundos y compruebe que la imagen tiene un número suficiente de fotones, como un pico de 100 fotones para un píxel de citoplasma dentro de la curva de desintegración de la vida útil de la fluorescencia. Si el número de fotones es demasiado bajo, aumente la potencia del láser o la duración de la adquisición de la imagen.
Para la imagen de dinucleótido de flavina adenina, o FAD, configure el láser multifotón a 890 nanómetros y espere a que el láser se bloquee en modo en la nueva longitud de onda. Asegúrese de que el control de potencia para el láser se ajuste a cero inicialmente. Establezca un filtro de emisión a 500 a 600 nanómetros.
Para optimizar la configuración de la imagen, comience a crear imágenes de manera enfocada o de visualización en vivo aumentando la potencia del láser a 5 a 10 milivatios y registrando la potencia máxima utilizada. Utilice la misma configuración de energía para las imágenes FAD de los campos de visión posteriores. Recoja la imagen FAD-FILM con un tiempo de integración de imagen de 60 segundos y compruebe que la imagen tiene suficientes fotones dentro de la curva de desintegración de la vida útil de la fluorescencia.
Si el número de fotones es demasiado bajo, aumente la potencia del láser o la duración de la adquisición de la imagen y repita la imagen para obtener de cuatro a cinco campos de visión adicionales, o FOV, con cada imagen espaciada a dos FOV de distancia. Para hacer una solución de cianuro de sodio 80 milimolar, disuelva 130.24 miligramos de cianuro de sodio en 25 mililitros de PBS. A partir del plato de cultivo, aspire 100 microlitros de medio de cultivo para reemplazar con 100 microlitros de solución de cianuro de sodio para obtener una concentración de cuatro milimolares de cianuro en el plato.
Coloque las células en una incubadora durante cinco minutos para permitir que las células reaccionen con la solución de cianuro. Después de la exposición al cianuro, adquiera imágenes NADPH y FAD de las células como se describió anteriormente. El estudio calculó los parámetros de la vida útil de la fluorescencia utilizando la función de respuesta del instrumento medida, o IRF, a partir de urea.
Los parámetros se promediaron a través de los píxeles del citoplasma de cada célula utilizada para la segmentación. Se identificaron células individuales y se enmascararon para eliminar el ruido de fondo. Luego, el núcleo fue identificado y proyectado sobre la máscara celular.
Además, las células se filtraron para eliminar las áreas enmascaradas que no se ajustan al tamaño de las células típicas. Las imágenes de por vida de fluorescencia de múltiples fotones de NADPH y FAD permitieron la visualización de la morfología celular y el metabolismo antes y después del tratamiento con cianuro. Se observó que la vida útil de NADPH disminuye con el tratamiento con cianuro, mientras que la vida útil de FAD aumenta después del tratamiento con cianuro.
El diagrama de caja representativo indicó que la relación redox óptica de las células MCF7 disminuyó después del tratamiento con cianuro. La exposición al cianuro disminuyó la vida útil de NADPH ponderada por amplitud de las células MCF7. Las vidas cortas y largas disminuyeron para NADPH, pero aumentaron para NADPH alfa uno.
Para FAD, la vida útil ponderada por amplitud de las células MCF7 aumentó después de la exposición al cianuro. Tanto la vida corta como la larga aumentaron para FAD, pero disminuyeron para FAD alfa uno. Es importante tener suficiente potencia láser para las muestras, pero recuerde, demasiada potencia puede causar daño a las células.
Debido a que las imágenes de autofluorescencia no dañan las células, se pueden usar ensayos bioquímicos posteriores en las mismas muestras.
