Se ha demostrado que el ensayo de protrusión del borde celular se correlaciona directamente con la migración celular. Por lo tanto, se puede utilizar como un método preliminar para identificar proteínas críticas y mecanismos de señalización involucrados en la motilidad celular. El método es rápido, simple, rentable y no requiere etiquetado fluorescente ni el uso de un costoso microscopio fluorescente.
Demostrando el procedimiento estará Michal Gendler, un estudiante de mi laboratorio. Agregue dos mililitros de una solución normal de ácido clorhídrico en el centro de un plato con fondo de vidrio e incube durante 20 minutos a temperatura ambiente. Lave el plato tres veces con dos mililitros de PBS.
Diluya la fibronectina a 10 microgramos por mililitro de concentración en PBS y agregue 200 microlitros de la solución diluida al plato central de vidrio. Incubar durante una hora a 37 grados centígrados. Prepare la solución 1% BSA y PBS y páselo a través de un filtro de 0,2 micrómetros.
Desnaturalizar la solución incubando a 70 grados centígrados durante 30 minutos en un baño de agua precalentada. Lave el plato con fondo de vidrio recubierto con dos mililitros de PBS tres veces. Agregue dos mililitros de solución de BSA desnaturalizada e incube el plato a 37 grados centígrados durante una hora.
Lave el plato de vidrio con dos mililitros de PBS tres veces. Antes de 16 a 18 horas de experimento a 0,7 millones de células por placa de cultivo de tejido de 10 centímetros de diámetro para lograr una confluencia del 70 al 80%. Al día siguiente, agregue dos mililitros de solución de tripsina a la placa de cultivo de tejido e incube durante dos o tres minutos hasta que las células se separen.
Agregue cinco mililitros del medio para inactivar la tripsina. Usando un hemaciómetro, cuente las celdas y la placa 20, 000 celdas en dos mililitros del medio completo en un plato inferior. Luego incube el plato con células chapadas en una incubadora durante 15 minutos.
Encienda la unidad de calefacción y configúrela a 37 grados centígrados una hora antes de la toma de imágenes. Además, encienda la unidad de dióxido de carbono y configúrela al 5% 10 minutos antes de la toma de imágenes. Encienda el microscopio y la cámara.
Encienda la computadora y abra el software de adquisición del microscopio. Ajuste el aumento en un contraste de fase de lente seca de 40X. Establezca la duración total de la película en 10 minutos con un intervalo de tiempo de cinco segundos.
Después de 15 minutos de incubación, coloque el plato con fondo de vidrio con células adheridas en un adaptador y fíjelo. Inserte el adaptador con el plato en las ranuras de la etapa del microscopio. Retire la tapa del plato, coloque la tapa de dióxido de carbono y abra la válvula de dióxido de carbono.
Localice una célula apropiada para la obtención de imágenes. Comience la adquisición de películas después de centrarse en la célula. Para realizar el análisis de imagen, seleccione la herramienta recta en el software de análisis de imágenes y haga ocho líneas de 20 unidades arbitrarias perpendiculares a las protuberancias en una disposición radial a cada 45 grados, incluyendo láminas y bordes celulares.
En la barra de herramientas principal, vaya a la imagen, seleccione Pilas y luego haga clic en Reslice para generar una imagen de kymograph que describa el movimiento de puntos individuales dentro de la membrana celular. Utilizando las imágenes del kymograph, extraiga y cuente manualmente el número de protuberancias, retracciones y volantes en cada una de las ocho regiones de la celda marcada por las líneas de la cuadrícula. Estos números representan la frecuencia de protuberancias, retracciones y volantes por 10 minutos.
Determinar la persistencia de la protuberancia, la distancia y la velocidad mediante análisis de quimografía. Para determinar la distancia de protuberancia, dibuje una línea perpendicular desde la base de la protuberancia hasta el pico más alto de la protuberancia. Presione M para medir la longitud de la línea en píxeles y asegúrese de que se sepa que la relación píxel-micrómetro convierte la longitud en micrómetros.
La cuantificación de protuberancias, reacciones y volantes se realizó manualmente por 10 minutos y la frecuencia promedio obtenida para protuberancias y retracciones fue de 5,1 y 2,1 para volantes. El kymograph representativo tenía una distancia de protuberancia de aproximadamente 4,8 micrómetros y un tiempo de protuberancia de aproximadamente 0,6 minutos. Se representa un ejemplo de una celda que debe excluirse del análisis.
El análisis de la gammagrafía reveló que la célula no estaba presente en su fase de propagación y no mostró ninguna protuberancia clara de la membrana. Lo más importante es elegir las células correctas para la obtención de imágenes. Una célula adecuada debe estar en su fase de propagación y no debe tocar otras células para evitar la comunicación y señalización célula-célula.
El método se puede utilizar como una herramienta preliminar para probar la dinámica citoesquelética que involucra la motilidad celular antes de decidir realizar más resultados que exijan ensayos de migración celular.
