Aquí, describimos un método de instrucción basado en una rápida inactivación térmica de la proteasa para preservar los péptidos intracelulares naturales, evitar la degradación en células y tejidos, seguido de una cuantificación relativa de péptidos utilizando el etiquetado isotópico. Este método de etiquetado tiene muchas ventajas. Los reactivos están disponibles comercialmente, son baratos, químicamente estables y permiten el análisis de hasta cinco muestras en un solo suero.
Comience cultivando células de neuroblastoma humano en un plato de 15 centímetros en DMEM que contiene 15% de FBS y 1% de estreptomicina de penicilina. Mantenga las células a 37 grados centígrados por debajo del 5% de dióxido de carbono. Lave las células dos veces con PBS, luego agregue 10 mililitros de PBS, raspe las células y recójalas en un tubo de 15 mililitros.
Centrifugar las células a 800 veces G durante cinco minutos y retirar el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet en un mililitro de agua desionizada ultra purificada a 80 grados centígrados, luego transfiera el contenido del tubo a un tubo de microfugio de dos mililitros. Después de la inactivación por calor del pez cebra, recoja todo el cerebro en un tubo de microfugio de dos mililitros y congélelo a menos 80 grados centígrados hasta el análisis.
Resuspender la muestra de tejido en un mililitro de agua desionizada ultra purificada a 80 grados centígrados y sonicar con una sonda utilizando 30 pulsos de un segundo. Incubar el lisado celular u homogeneizar el tejido a 80 grados centígrados durante 20 minutos, luego enfriarlo en hielo durante 10 a 30 minutos. Añadir 10 microlitros de una solución madre de ácido clorhídrico molar por cada mililitro de volumen de muestra.
Mezclar mediante vórtice durante 20 segundos e incubar en hielo durante 15 minutos. Centrifugar el lisado celular o el tejido homogeneizado a 12.000 veces G en cuatro grados centígrados durante 15 minutos. Recoja el sobrenadante en tubos de microcentrífuga de proteína de baja unión y guárdelo a menos 80 grados centígrados.
Limpie los dispositivos de ultrafiltración con agua y centrífuga a 2, 300 veces G durante tres minutos, luego deseche el agua del dispositivo de ultrafiltración. Pipetee el sobrenadante en un filtro de corte de 10 kilodalton prelavado y haga girar en una centrífuga refrigerada a cuatro grados centígrados. Compruebe el pH de la muestra.
Equilibre la columna con un mililitro de 100% acetonitrilo, luego lávelo con un mililitro de 5% de acetonitrilo con ácido trifluoroacético al 0.1%. Cargue el volumen completo de la muestra en la columna y lave la columna con un mililitro de acetonitrilo al 5% con ácido trifluoroacético al 0,1%. Eluye los péptidos de la columna con 1,8 mililitros de acetonitrilo al 1% con ácido trifluoroacético al 0,15% en tubos de microcentrífuga de baja unión proteica.
Seque la muestra completamente en una centrífuga de vacío a 30 grados centígrados y controle el tiempo de concentración en exhibición. Guarde la muestra a menos 80 grados centígrados. Resuspender las muestras de péptidos en 100 a 200 microlitros de agua ultra purificada y pipetear 2.5 microlitros de las concentraciones de péptidos estándar y muestras en la placa blanca de 96 pocillos.
Añadir 25 microlitros de tampón de fosfato molar 0,2 y 12,5 microlitros de fluorescamina. Homogeneizar suavemente durante un minuto en el rotador orbital. A continuación, agregue 110 microlitros de agua para detener la reacción.
Ajuste la configuración del espectrofluorómetro y, a continuación, lea la placa. Agregue 1/10 de volumen de bromuro de trimetilamonio molar a cada muestra de péptido con hasta 25 microgramos del péptido. Asegúrese de que el pH esté entre cinco y ocho, ajustando con ácido clorhídrico o hidróxido de sodio, si es necesario.
Agregue cuatro microlitros de formaldehído no deuterado, deuterado o formaldehído deuterado de carbono-13. Mezclar durante cinco segundos mediante vórtice. Agregue cuatro microlitros de cianoborohidruro de sodio o cianoborohidruro de sodio deuterado a la muestra de péptidos.
A continuación, mezcle la muestra durante cinco segundos mediante vórtice. Incubar la muestra de péptido en una campana extractora de humos durante dos horas a temperatura ambiente, vórtice cada 30 minutos. Repita la adición de formaldehído deuterado no deuterado, deuterado o carbono-13 y cianoborohidruro de sodio o cianoborohidruro de sodio deuterado, vórtice después de cada adición.
Incubar las muestras en la campana extractora de humos durante la noche a temperatura ambiente. Añadir 16 microlitros de bicarbonato de amonio y mezclar por vórtice. Coloque la muestra sobre hielo.
Agregue ocho microlitros de ácido fórmico al 5% y vórtice durante otros cinco segundos. Combine las muestras de péptidos, ajuste el pH entre dos y cuatro, luego desalar las muestras combinadas en columnas de limpieza de fase invertida utilizando acetonitrilo y ácido trifluoroacético como se describió anteriormente. Seque la muestra completamente en una centrífuga al vacío a 30 grados centígrados, luego guárdela a menos 20 grados centígrados.
Los péptidos marcados se observan utilizando espectros de masas. Las flechas rojas indican la presencia de pares máximos de diferentes péptidos marcados con dos formas isotópicas, L1 y L5, para la comparación entre dos muestras diferentes S1 y S2 respectivamente. El espectro de masas de un péptido presente en tres muestras diferentes, S1, S2 y S3, etiquetadas con etiquetas L1, L3 y L5 respectivamente se muestra aquí.
Se realizó un etiquetado cuadrúplex. Las muestras de control S1 y S3 fueron etiquetadas con L1 y L3 respectivamente y comparadas con dos muestras experimentales, S2 y S4 marcadas con L2 y L4.No se observó diferencia significativa. El etiquetado isotópico se utilizó para mostrar sustratos en productos in vitro para una proteasa o peptidasa dada.
Aquí se muestra un péptido que no cambia en presencia de la enzima neurolisina. Los péptidos que desaparecen o se reducen en presencia de la enzima son sustratos, mientras que los que aumentan se consideran productos. La figura es un ejemplo de identificación de una secuencia peptídica realizada por un motor de búsqueda de base de datos etiquetado con tres formas diferentes de etiquetas.
Antes de que se defina, asegúrese de que la muestra esté completamente fría para evitar romper los enlaces peptídicos causados por la acidificación dura. Además, la limpieza de los dispositivos de ultrafiltración es esencial. La espectrometría de masas es un excelente método para cuantificar péptidos entre diferentes condiciones experimentales y para estudios de análisis mediante la identificación de sustratos de peptidasa.
