Este protocolo proporciona información microestructural sobre enfermedades patológicas estructurales a escala de todo el órgano utilizando tomografía microinformática. En este protocolo, se implementa un método especializado de preparación de tejidos para optimizar las imágenes de alta resolución de muestras de corazón entero a partir de modelos traslacionales de mamíferos grandes en humanos con mejora selectiva del contraste de enfermedades estructurales. La microestructura cardíaca, como la distribución de la fibrosis y la organización del miocardio excitable, subyace a un amplio espectro de enfermedades cardíacas y prepara el escenario para la arritmia potencialmente mortal.
Demostrando el procedimiento estará Nestor Pallares-Lupon, un postdoctorado y graduado de doctorado para mi laboratorio. Para comenzar, prepare una solución cardiopléjica que contenga heparina sódica y almacene la solución a cuatro grados centígrados. A continuación, prepare PBS / EDTA agregando primero EDTA a un litro de agua destilada para una concentración final de 10 milimolares.
Luego aumente y mantenga el pH de la solución a 12 usando hidróxido de sodio para disolver el EDTA. Una vez que el EDTA esté completamente disuelto, reduzca el pH a 7.4 usando ácido clorhídrico. Luego agregue una bolsa de lámina de PBS para obtener una solución molar de 0.01 con pH 7.4.
Guarde la solución preparada a temperatura ambiente. Finalmente, prepare una solución de agente de contraste PMA al 1% de etanol agregando 10 gramos de PMA a un litro de etanol absoluto. Guarde la solución preparada a temperatura ambiente.
Prepare un depósito de un litro apoyado a 80 centímetros por encima de un plato de disección y acople un tubo termoplástico a un puerto de drenaje del depósito. Fije un grifo de tres vías al tubo de drenaje y acople más tubos termoplásticos a cada puerto libre en el grifo de tres vías. Fije los grifos bidireccionales en los extremos libres del tubo.
A continuación, llene el reservorio con la solución cardiopléjica suplementada con heparina. Abra los grifos para permitir que la solución cardiopléjica drene eliminando todas las burbujas de aire. A continuación, cierre los grifos bidireccionales.
Después de extraer el corazón de un animal sacrificado, colóquelo en una solución cardiopléjica fría almacenada en hielo hasta que esté lista para la disección. Luego prepare la cánula para el osteo coronario izquierdo y derecho cortando cinco centímetros de tubo de PTFE y calentando un extremo colocando la punta junto a una llama desnuda. Una vez que un milímetro de la punta comienza a derretirse y se vuelve translúcida, presione la punta contra una superficie dura resistente al calor para dar forma a una cresta en la punta de la cánula para evitar que la cánula se deslice fuera de los recipientes, luego inserte un centímetro del extremo no calentado de cada cánula en los dos extremos del tubo de drenaje del depósito de drenaje.
A continuación, retire la cánula aórtica y localice el osteo izquierdo y derecho de las arterias coronarias debajo de la solución cardiopléjica fría. Usando tijeras puntiagudas, separe cuidadosamente la raíz aórtica del tejido circundante por encima y por debajo del osteo coronario para permitir el enhebrado de una sutura de seda de calibre cero debajo del vaso coronario. Luego abra los grifos bidireccionales e inserte las puntas de la cánula en el osteo coronario.
Con las puntas de la cánula que se extienden de uno a dos centímetros en el osteo y más allá de la colocación de la sutura, ate la cánula. A continuación, enjuague el corazón mientras masajea suavemente los ventrículos durante 15 minutos hasta que el corazón se limpie de sangre. Después del enjuague, cierre los grifos bidireccionales, desconéctelos del grifo de tres vías y transfiera el corazón a un recipiente de plástico resistente a productos químicos de un litro que contenga 500 mililitros de solución de PBS / EDTA.
Recircule la solución de PBS/EDTA en el tubo termoplástico bajo una campana extractora de humos utilizando una bomba peristáltica con dos canales. Prepare el tubo de la bomba hasta que el tubo esté ausente de burbujas de aire. Luego examine detenidamente cada cánula de la arteria coronaria mediante recirculación a temperatura ambiente durante dos horas a 80 mililitros por minuto.
Después de asegurarse de que la campana de humos esté operativa, detenga la bomba, drene la solución del recipiente y reemplácela con 10% de formalina para su fijación durante una hora a 80 mililitros por minuto. Examine el corazón utilizando una serie de concentraciones incrementales de etanol, comenzando con 20% de etanol durante un mínimo de tres horas. Luego reemplace el etanol al 20% con etanol al 30% y perfunda durante dos horas.
Continúe la perfusión incrementando la concentración de etanol en cada iteración con una perfusión mínima de una hora en cada concentración. Para reforzar el tejido cardíaco antes del secado al aire, recircule una mezcla igual de etanol y HMDS durante 10 minutos, seguido de 100% HMDS durante otras dos horas. Detenga la bomba de perfusión, luego desconecte la cánula del tubo y suspenda el corazón de una sutura aórtica dentro de la campana de humos.
Deslice cuidadosamente una bolsa con cierre hermético sobre el corazón y cierre el sello de la bolsa sobre la sutura para reducir la exposición del corazón al aire circulante. Deje que el corazón se seque a través de la evaporación durante una semana. Para los agentes de contraste de carga por difusión, retire la bolsa.
Lave el corazón en etanol 100% durante 15 minutos con agitación antes de sumergirlo en etanol 100% suplementado con 1% PMA durante 48 horas al vacío, luego cubra el corazón con una bolsa con cierre hermético como se demostró anteriormente y deje que se seque. Monte el corazón secado al aire en un soporte de muestra apropiado. Para evitar cualquier movimiento durante las mediciones de micro TC de rayos X, use una abrazadera anclada al soporte de la muestra y asegure el corazón a través de la aorta seca y rígida.
Monte el soporte de muestra en el escáner micro CT. A continuación, abra el software e inicie el sistema de micro TC de rayos X. Luego ajuste el filtro de rayos X de aluminio a un milímetro.
Voltaje de fuente de rayos X a 60 kilovoltios y corriente a 120 microamperios. Además, establezca las dimensiones de la imagen en 2, 016 por 1, 344 píxeles y el tamaño de píxel en 20 micrómetros. Explore imágenes de transmisión de rayos X a lo largo de la longitud del soporte para determinar el campo general de imágenes en el acceso longitudinal del corazón.
Para el escaneo, use un paso de rotación de 0.18 grados, un marco promedio de cinco y una rotación de muestra de 180 grados anulando la selección de la opción para una adquisición de 360 grados. Seleccione el modo de escaneo de desvío para obtener una imagen de todo el ancho del soporte de muestra. Después de escanear, use el software para la reconstrucción tomográfica de un volumen de imagen tridimensional isotrópica.
En el software de reconocimiento final, utilice la corrección de artefactos relacionada con la adquisición, incluidos los efectos de endurecimiento del haz del 10% y la reducción del artefacto del anillo de ocho. A continuación, utilizando el software Data Viewer, visualice la pila de datos reconstruida. Orientar digitalmente la muestra dentro de los límites de la imagen para realinear los ejes largo y corto de las muestras con los tres principios un eje del volumen de la imagen.
Finalmente, recorte el volumen de la imagen en los tres ejes para eliminar las capas de fondo externas de la imagen y reducir al máximo el tamaño total de la imagen. Las imágenes de transmisión de rayos X de corazones de cerdo secados al aire muestran los principales puntos de referencia anatómicos, incluidas las cavidades ventriculares y la pared muscular. Las reconstrucciones tomográficas de volúmenes de imágenes tridimensionales mostraron una clara separación entre el tejido y el fondo en los límites epicárdico y endocárdico.
La tinción tricrómica de Mason mostró tinción positiva de colágeno en las capas epitelial y endotelial paravascularmente en el tejido subepistárdico. La iluminación de campo brillante mostró una coloración más oscura en las estructuras colágenas después de la tinción de PMA, lo que respalda la acumulación preferencial de PMA. Las imágenes fluorescentes teñidas con PMA de secciones de tejido ventricular tenían una pérdida de fluorescencia inducida por PMA en sitios de colágeno.
Cuando una muestra de corazón se tiñó con un agente de contraste a través de la perfusión antes del secado al aire, la reconstrucción de la imagen reveló una tinción altamente irregular dentro del compartimiento del miocardio. Además, el tejido de bajo contraste mostró una separación deficiente de la intensidad de fondo. Las imágenes micro tc de una parte de oveja que sufría de infarto crónico de miocardio revelaron una lesión fibrótica densa central rodeada por una zona fronteriza suelta y heterogénea.
Las mayores intensidades de señal de los volúmenes de imagen reconstruidos en los límites del tejido y las regiones de la cicatriz se muestran aquí. Los agentes de contraste tiñeron mal el miocardio sano, sin embargo, se conservó el contraste micro estructural. En la zona fronteriza, el tejido cicatricial se intercaló con el miocardio sobreviviente.
La fibrosis densa apareció transmural pero texturizada, lo que indica variaciones en la composición. La región transmural del ventrículo izquierdo de la preparación de tejido teñido con PMA mostró tinción selectiva para el colágeno y ninguna tinción en las regiones de miocardio sobreviviente. Se recomiendan tiempos de perfusión más largos con etanol para garantizar el intercambio completo del contenido de agua del corazón con etanol.
Las interacciones entre hmds y el agua producen calor, lo que puede dañar la muestra. Una gran ventaja de este procedimiento es la capacidad de validar imágenes micro TC utilizando histología. Las muestras secas al aire se pueden incrustar directamente en parafina para seccionar tinciones e imágenes microscópicas.
