La técnica permite estudiar la función y el rango de las moléculas de señalización durante la embriogénesis mediante el trasplante de fuentes de señalización ectópica. También facilita la generación eficiente de mutantes de la línea germinal. El protocolo se puede aplicar a embriones de pez cebra y medaka en etapa de blástula, y probablemente también a otras etapas embrionarias y especies de TDO.
Para montar el dispositivo de trasplante, conecte una jeringa hermética de gas de 25 microlitros con punta de señuelo a un soporte de micro pipeta utilizando el accesorio de bloqueo de señuelo. A continuación, monte el dispositivo directamente en un micromanipulador manual. Para usar el dispositivo de trasplante, coloque el micromanipulador con el dispositivo ensamblado junto a un microscopio estéreo.
Luego retire el émbolo e inserte la aguja de trasplante. Baje la aguja en un plato lleno de solución de Ringer en un ángulo de 45 grados hasta que la punta de la aguja se sumerja. Inserte el émbolo aproximadamente hasta la mitad para eliminar las soluciones de Ringer, dejando solo un pequeño volumen de agua en la parte delgada y cónica de la aguja.
Cuando use una aguja de trasplante por primera vez, cubra el interior de la aguja extrayendo el yugo de un embrión sacrificado y expulsando el material del yugo por completo. A continuación, con una aguja de trasplante, coloque suavemente el embrión donante, luego coloque la abertura ortogonal de la aguja en la superficie del embrión y tire cuidadosamente del émbolo para atraer las células a la aguja. Una vez que se extrae el número deseado de células, detenga la succión empujando suavemente el émbolo hacia abajo y retire la aguja del embrión sacudiendo la aguja hacia un lado en un movimiento corto y rápido.
Deje un poco de solución de Ringer a cada lado de la columna celular restringiendo las celdas al extremo cónico de la aguja. Limpie cualquier resto de yema o residuos celulares moviendo lentamente el émbolo hacia arriba y hacia abajo y lavando las células con la solución de Ringer. A continuación, mueva la placa de trasplante con la mano no dominante para colocar la aguja ortogonal en la superficie del embrión huésped.
Aplique una ligera presión sobre el embrión apretándolo cuidadosamente contra las paredes. Luego, con un movimiento rápido y agudo, perfore la capa envolvente del embrión huésped teniendo cuidado de no rascar la yema con la aguja. Una vez que la aguja esté dentro, empuje suavemente el émbolo para extruir la columna de células en el embrión y retraiga lentamente la aguja simultáneamente.
Para el trasplante de células germinales, llene un plato de trasplante con la solución de Ringer, luego transfiera la esfera decorionada a los embriones de etapa de cúpula en el plato de trasplante y coloque los embriones del huésped y el donante en columnas alternas para trasplantar las células de un embrión donante a seis embriones huésped diferentes. Para llevar a cabo el trasplante, oriente los embriones con el margen hacia la aguja de trasplante. Para el trasplante de línea germinal, tome las células de origen del margen y depositelas en la misma ubicación en el embrión huésped.
Una vez que se complete el trasplante, permita que el embrión se recupere en la solución de Ringer durante 30 minutos a una hora. Luego, usando un microscopio estereoscópico de fluorescencia, examine las células trasplantadas. A continuación, transfiera los embriones a una placa recubierta de agarosa de 24 pocillos con medio embrionario que agrupa todos los embriones huésped que recibieron células del mismo donante en el mismo pozo.
Luego incubar los embriones a 28 grados centígrados hasta el día siguiente. Si es necesario, transfiera los embriones de la donante a tiras de PCR marcadas para el genotipado. 30 horas después de la fertilización, examine los embriones huéspedes para trasplantes exitosos de la línea germinal bajo un microscopio estereoscópico de fluorescencia.
Las células germinales deben estar presentes en el surco por encima de la extensión de la yema. Cultive la larva trasplantada con éxito a la capucha adulta de acuerdo con las condiciones de cría estándar. En los trasplantes exitosos, el embrión se ve normal y similar en forma y claridad de yema a los embriones no trasplantados sin grandes desgarros en el blastodermo.
Por el contrario, si un embrión se daña visiblemente durante el trasplante, no se desarrollará normalmente. Aunque el dispositivo de trasplante se ha utilizado principalmente en embriones de pez cebra en etapas de blástula, el trasplante y la extirpación celular también se pueden llevar a cabo en embriones de etapa de blástula descoronada del pez arroz japonés medaka. En el caso específico del trasplante de línea germinal, un buen trasplante da como resultado un embrión con una larga columna horizontal de células directamente por encima del margen de la yema.
Sin embargo, el éxito del procedimiento solo se puede evaluar después de 24 a 30 horas de fertilización cuando las células germinales son distintas en su fluorescencia de las células somáticas. Las células germinales primordiales aparecerán como pequeñas esferas fluorescentes en el surco directamente sobre la extensión de la yema. La presencia de estas células germinales en la ubicación correcta indica un trasplante exitoso de la línea germinal.
Aquí se muestran ejemplos de trasplantes fallidos. En el primer ejemplo, aunque las células germinales han alcanzado el mesodermo gonadal, como el embrión huésped está severamente deformado, no se desarrollará normalmente. En el segundo ejemplo, las células fluorescentes solo se detectan fuera de la ranura.
Estas células son células somáticas o células germinales que no pudieron migrar correctamente. Y ambos tipos de células no contribuirán a la línea germinal del embrión. Es fundamental evitar el daño a las células trasplantadas y al embrión huésped.
Las células deben extraerse lentamente, limpiarse de cualquier yema restante e insertarse con cuidado. Este método proporciona una manera fácil de trasplantar células en embriones de pez cebra, y será útil para generar fuentes ectópicas y mutantes de la línea germinal. La principal ventaja de este dispositivo, es de bajo costo, y es mucho y utiliza.
