Nuestro método permite evaluar la composición y las características funcionales de las diferentes subpoblaciones de linfocitos presentes en el tejido uterino de animales preñados y no preñados. Este protocolo permite el aislamiento de los linfocitos uterinos al tiempo que preserva la expresión superficial de proteínas, la viabilidad celular y la funcionalidad. Por lo tanto, es adecuado para una amplia gama de aplicaciones posteriores.
La extracción del feto al comienzo del experimento y la recolección de leucocitos son pasos técnicamente desafiantes. Dado que es un experimento largo, se necesita atención y enfoque particulares una vez que haya alcanzado los pasos de tinción de anticuerpos. Para comenzar, transfiera el tejido del útero cosechado de una ratón hembra C57 negra C57 embarazada a una placa de Petri estéril, luego use instrumentos estériles elimine suavemente la grasa que rodea el tejido, teniendo cuidado de no dejar que el tejido se seque.
Extraiga los fetos diseccionando cada sitio de implantación con instrumentos estériles, luego devuelva el útero a su tubo de recolección original de cinco mililitros que contiene un mililitro de medios de recolección. Usando tijeras, picar el tejido en el tubo de recolección, luego coloque el tubo en un baño de agua de 37 grados Celsius. A continuación, agregue tres mililitros de mezcla de digestión enzimática precalentada al tubo.
Incubar el tubo durante 30 minutos a 37 grados centígrados con agitación para mejorar la actividad de digestión enzimática. Después de que se complete la incubación, vórtice el tubo y manténgalo en hielo para inhibir la actividad enzimática, luego transfiera el tejido digestivo a un tubo de centrífuga de 15 mililitros debidamente etiquetado. Enjuague el tubo de recolección de cinco mililitros con un total de 10 mililitros de solución de EDTA PBS de cinco milimolares helados para recolectar todo el tejido restante y transferirlo al tubo centrífugo de 15 mililitros.
Centrifugue la muestra de tejido digerido durante 10 minutos a 400 veces G.Deseche el sobrenadante, mueva suavemente el gránulo y luego vuelva a suspenderlo en 10 mililitros de solución EDTA PBS de cinco milimolares precalentada. Para reducir la aglomeración celular, incube la muestra a 37 grados centígrados con agitación, seguido de vórtice en alto durante 10 segundos. Para eliminar grupos celulares en el tejido no asociado, coloque un colador de 70 micrómetros encima de un tubo de centrífuga estéril de 50 mililitros, luego use el émbolo de una jeringa estéril de un mililitro, fuerce el tejido digerido a través del colador hacia el tubo.
Lave el colador varias veces con un total de 10 mililitros de PBS frío para recolectar todas las células, luego pase el tubo centrífugo de 50 mililitros durante 10 minutos a 400 veces G.Después de desechar el sobrenadante, las células linfoides innatas pueden aislarse utilizando la opción A o la opción B.Para la opción A, resuspenda el pellet en cinco mililitros de 80% isotónico por llamada usando un voy de pipeta. Luego, usando el voy de pipeta a baja velocidad, superponga cuidadosamente ocho mililitros, 40% por solución de llamada, sobre el pellet resuspendido en un tubo de centrífuga de 15 mililitros. Pipete lenta y continuamente, manteniendo los 15 mililitros a un ángulo de aproximadamente 45 grados.
Sin alterar la superposición, centrifuga el tubo durante 20 minutos a 850 veces G con aceleración media y roturas mínimas a temperatura ambiente. Una vez completada la centrifugación, retire cuidadosamente el tubo de la centrífuga sin perturbar las capas por llamada. A continuación, sin perturbar el anillo de leucocitos en la interfaz de las dos soluciones por llamada, use una pipeta pasteur estéril para descartar todas excepto 0.5 a un mililitro de la capa superior por llamada.
Mientras intenta mantener la cantidad de solución por llamada aspirada en la pipeta al mínimo, recoja cuidadosamente el anillo de leucocitos y transfiera las células a un nuevo tubo de centrífuga de 15 mililitros marcado. Agregue 10 mililitros de medio RPMI estéril suplementado con 10% de calor y FBS activado a las células, luego centrifugue las células durante cinco minutos a 500 veces G y cuatro grados Celsius. Deseche el sobrenadante y proceda a la lisis de glóbulos rojos.
Para aislar las células usando la opción B, después de pasar el tejido digerido a través del colador celular y centrifugar el resultado en suspensión celular como se demostró anteriormente, resuspenda el pellet con ocho mililitros de 35% isotónico por llamada y medio RPMI, y transfiera las células a un tubo de 15 mililitros. Centrifugar el tubo a 940 veces G durante 10 minutos a temperatura ambiente con aceleración media y descansos mínimos. Luego, usando un aspirador o un voy de pipeta, aspire el sobrenadante con cuidado antes de volver a suspender el pellet en 14 mililitros de medio RPMI suplementado con 10% de calor y FBS activado.
Centrifugar la muestra de nuevo durante cinco minutos a 500 veces G y cuatro grados centígrados, luego desechar el sobrenadante por aspiración y proceder a la lisis de glóbulos rojos. Para lisar los glóbulos rojos, vuelva a suspender la muestra en tres mililitros de una solución de lisado de glóbulos rojos X e incube durante tres minutos a temperatura ambiente, luego agregue 10 mililitros de PBS a la muestra para detener la reacción. Centrifugar el tubo a 400 veces G durante cinco minutos después de desechar el sobrenadante, agregar otros 10 mililitros de PBS y repetir la centrofugación.
Resuspend el pellet en un mililitro de medio RPMI suplementado con FBS inactivado al 10% de calor, luego pase la suspensión en células a través de un colador celular estéril de 70 micrómetros. Después de contar las células, ajuste la concentración de la suspensión celular a uno a 2 millones de células en 100 microlitros de PBS y proceda a la tinción y al análisis de facs. Las ILC uterinas del grupo uno incluyen células NK convencionales, células NK residentes en tejidos y ILC del grupo uno con sus porcentajes que varían durante la vida y el embarazo.
Estos subconjuntos se pueden discriminar mediante citometría de flujo al marcar primero las células sobre su capacidad para dispersar la luz, luego aislar las células CD 19 negativas CD 19 negativas y luego identificar las ILC del grupo uno que son NK 1.1 y NKP 46 positivas. Dentro de las ILC del grupo uno, las EM CD49A negativas positivas son células NK convencionales. Las células EMs positivas CD49A positivas son células NK residentes en el tejido.
Y las células EMS negativas CD49 positivas son ILC uterinas del grupo uno. La tinción de linfocitos esplénicos y uterinos con anticuerpos anti NK P46 y anti NK 1.1 muestra que los linfocitos esplénicos expresan mayores cantidades de NKP 46 en su superficie que su contraparte uterina. En la disociación enzimática del tejido, los epítopos superficiales pueden alterarse dependiendo de las enzimas utilizadas en el medio de digestión.
Por ejemplo, la tinción para el receptor MHC CD49 NKG2A es deficiente cuando se utiliza liberase TM. Sin embargo, la digestión con liberasa DH preserva el reconocimiento de NKG2A por el clon de anticuerpos 1611. Alrededor del 6,5% de las ILC del grupo uno presentes en muestras de tejido uterino en el día de gestación 8,5 son derivadas de la sangre.
Los contaminantes sanguíneos se pueden excluir a través de la tinción intravital con anticuerpos anti CD45 conjugados con un fluorocromo. Al preparar reuniones de tiempo, debe tener en cuenta que los ratones son nocturnos. Por lo tanto, deben instalarse lo más tarde posible por la tarde, ya que el apareamiento ocurrirá durante la noche.
También al seleccionar mujeres, debe asegurarse de que no tengan un tabique vaginal. Por lo general, hacemos análisis de citometría de flujo para observar muchas proteínas en el exterior de las células y dentro de las células. También hacemos extracción de ácido nucleico para estudiar la expresión génica, incluida la secuenciación de ARN.
Y también logramos alrededor de ensayos funcionales para estudiar las respuestas de las células linfoides innatas uterinas.
