El protocolo presentado se utiliza para el cribado de alto rendimiento y la identificación de nanocuerpos inhibitorios y no inhibitorios dirigidos a transportadores electrogénicos reconstituidos en proteoliposomas o presentes en vesículas de membrana. El diseño de ensayos de transferencia puede ser difícil en múltiples casos, especialmente si no se dispone de sustratos etiquetados. Si la misma electrofisiología permite estudiar el efecto de los nanocuerpos en el transporte de prácticamente cualquier transportador electrogénico, ya que la electrofisiología SSM no requiere sustratos etiquetados.
Los nanocuerpos han sido investigados por su uso en aplicaciones médicas. Esta técnica puede ayudar a detectar inhibidores potenciales dirigidos a transportadores electrogénicos específicos de humanos o patógenos humanos. Para comenzar, tome 10 tubos limpios y transfiera 10 mililitros de la membrana sólida no activada, o SSM, tampón en cada tubo.
Para preparar los tampones SSM activadores, agregue el sustrato en los tubos utilizando una serie de concentraciones alrededor de la mitad de la concentración máxima esperada. Inicie el software de SSM y deje que la máquina se inicialice automáticamente. Establezca la ruta de guardado de los datos.
Confirme presionando el botón OK. Seleccione el protocolo de limpieza inicial estándar en las opciones del flujo de trabajo y haga clic en ejecutar. A continuación, monte el chip recubierto de proteoliposoma en el zócalo.
Mueva el brazo para bloquear el chip. Encierre el chip montado con la tapa. Seleccione el programa CapCom en el flujo de trabajo y déjelo ejecutar para determinar la conductividad y la capacitancia.
Confirme que la conductividad está por debajo de cinco nanosiemens y la capacitancia está entre 15 y 35 nanofaradios antes de usarlo para la medición. Transfiera las soluciones de activación a viales y coloque los tampones en el muestreador de sonda. Transfiera el búfer no activador a un depósito y colóquelo junto al soporte del chip en la posición del depósito a la derecha.
Cree un protocolo para el flujo de trabajo mediante una secuencia de solución no activante, activadora y no activante, o una secuencia BAB, en un bucle que realice tres mediciones y se mueva al siguiente búfer de activación para los 10 búferes. Utilice el caudal predeterminado de 200 microlitros por segundo con tiempos de flujo de un segundo, un segundo y un segundo para la secuencia BAB y haga clic en reproducir para iniciar la medición. Guarde el protocolo y deje que el flujo de trabajo se ejecute haciendo clic en el botón de reproducción.
Luego realice el mismo experimento utilizando liposomas libres de proteínas. Utilice cualquier software preferido para el análisis de datos para trazar la corriente medida frente al tiempo y utilice la función para la estimación de la altura máxima en el rango de la adición del búfer de activación. Trazar la corriente máxima contra la concentración de sustrato para determinar el efecto medio máximo de concentración, o EC50, del sustrato a través de la regresión no lineal.
Transfiera 50 mililitros del búfer SSM no activante a un tubo limpio. Agregue la colina de sustrato a una concentración final de cinco milimolares y úsela para una medición de control positiva. Transfiera 10 mililitros del búfer SSM no activador a un tubo limpio.
Agregue colina de sustrato a cinco milimolares y nanocuerpo a una concentración final de 500 nanomolares. Repita el paso para cada nanocuerpo para preparar las soluciones de activación como se ha demostrado. Inicie la máquina SSM y mida la capacitancia y la conductividad del chip recubierto de proteoliposoma, como se demostró anteriormente.
Transfiera la solución activadora sin un nanocuerpo a un vial y coloque el tampón en el muestreador de la sonda. Transfiera el búfer no activante sin un nanocuerpo a un depósito y colóquelo en el muestreador de la sonda. A continuación, repita este proceso para todas las soluciones que contengan nanocuerpos con solución activante y no activante.
Cree un protocolo para el flujo de trabajo mediante una secuencia BAB. Cree un bucle que realice tres mediciones de la secuencia BAB utilizando tampones sin nanocuerpos, dos mediciones de la secuencia BAB con tampones que contengan un nanocuerpo, 120 segundos de tiempo de retardo de incubación con el nanocuerpo y tres mediciones de la secuencia BAB con tampones que contengan el nanocuerpo. Guarde el flujo de trabajo y deje que se ejecute haciendo clic en el botón de reproducción.
A continuación, cree un nuevo protocolo para el flujo de trabajo utilizando una secuencia BAB y un bucle de cinco mediciones para eliminar el nano cuerpo unido reversiblemente. Guarde el flujo de trabajo y deje que se ejecute haciendo clic en el botón de reproducción. Compare la última corriente máxima de las mediciones con la medición inicial de solo sustrato.
Si la corriente máxima alcanza el valor inicial, el nanocuerpo se ha lavado con éxito y se han restablecido las condiciones iniciales. De lo contrario, repita el flujo de trabajo o cambie a un nuevo chip. Repita este proceso utilizando chips individuales para cada pantalla de nanocuerpos, o repita con múltiples nanocuerpos usando el mismo chip.
Utilice cualquier software preferido para el análisis de datos para trazar la corriente medida frente al tiempo. Luego, el software selecciona automáticamente la función para la estimación de la altura máxima en el rango de la adición del búfer de activación. Normalice la corriente máxima y la presencia del nanocuerpo en función de la medición de solo sustrato.
Traza las corrientes máximas en el histograma y compara las corrientes máximas de las mediciones solo de sustrato con las corrientes máximas medidas en presencia de nanocuerpos para identificar nanocuerpos inhibitorios. Transfiera 50 mililitros del tampón SSM no activante a un tubo limpio y agregue la colina de sustrato a una concentración final de cinco milimolares, y use esto como solución activadora para el control positivo. Agregue cinco mililitros de la solución no activante a ocho tubos limpios, luego agregue colina de sustrato y nanocuerpos inhibitorios a los tubos a concentraciones en el rango esperado de IC50.
Agregue 10 mililitros de la solución no activante a los ocho tubos y agregue nanocuerpos inhibitorios a cada tubo correspondiente al tampón de no activación. Inicie la configuración de SSM y mida la capacitancia y la conductividad del chip recubierto de proteoliposoma. Transfiera la solución activadora sin nanocuerpo a un vial y colóquela en el muestreador de la sonda.
A continuación, transfiera el búfer no activante sin nanocuerpo a un depósito y colóquelo en la posición del depósito junto al soporte del chip a la derecha. Transfiera las soluciones activantes y no activantes que contienen nanocuerpos a viales y coloque los tampones en el muestreador de la sonda. Cree un protocolo para el flujo de trabajo mediante una secuencia BAB.
Incluye un bucle para medir cada concentración dos veces, incubar durante 120 segundos y medir tres veces más. Utilice cualquier software preferido para el análisis de datos para trazar la corriente medida frente al tiempo y seleccione la función para la estimación de la altura máxima en el rango de la adición del búfer de activación. Trazar las corrientes máximas contra la concentración de nanocuerpos para determinar el IC50 a través de la regresión no lineal.
Para determinar la concentración de sustrato que se utilizará durante un cribado de nanocuerpos, se midió el transporte electrogénico bajo diferentes concentraciones de sustrato para determinar EC50. Se seleccionó una concentración de sustrato correspondiente a las condiciones de saturación, cinco milimolares, y se mantuvo constante en todos los tampones de activación. El efecto de los nanocuerpos inhibitorios sobre el transporte electrogénico se visualizó a partir de la disminución de las amplitudes de las corrientes máximas.
Después de ejecutar el protocolo de lavado para permitir la desvinculación de nanocuerpos, se observó una recuperación del 80 al 95% de la amplitud de corriente máxima inicial. Al cambiar de condiciones de no activación a activación, los nanocuerpos presentes en estos tampones no introdujeron corrientes de artefacto significativas. Después de seleccionar nanocuerpos con propiedades inhibitorias, se determinaron los valores de IC50 para nanocuerpos individuales.
Es crucial dar suficiente tiempo para la calibración de los proteoliposomas en el chip con el búfer que contiene el nanocuerpo. Dado que la unión es reversible, el nanocuerpo debe estar presente tanto en los búferes activadores como en los no activadores.
