This work was supported by NSF/DBI-1255991 grant to IML.

1. Preparación del capilar Microreactor <ol><li> Cortar el diámetro interior 100 mm (ID) x capilar 360 micras de diámetro exterior (OD) a una longitud de 7-8 cm, y el 20 micras ID x 90 micras OD capilar a 3-5 cm con la cuchilla de capilar de vidrio; verificar en el microscopio que ambos extremos capilares tienen un corte limpio y recto, sin las rebabas que sobresalen. </li><li> Insertar el 20 micras ID x 90 micras capilar OD en un extremo de la 100 micras ID x 360 micras capilar OD, para una longitud de ~ 6 mm; en caso de necesidad, observar esta operación bajo un microscopio. </li><li> Aplique una pequeña gota de pegamento E6000 alrededor de la unión de los capilares 90 micras OD / ID 100 micras con el fin de un Q-tip, y dejar que la cura pegamento O / N a temperatura ambiente. </li><li> Cortar el 20 micras ID x 90 micras capilar OD insertado a una longitud de ~ 10-15 mm; este será el emisor de ionización electrospray. </li><li> -Pre cortar el 1/32 &quot;OD PEEK, 1/16&quot; PEEK OD y OD bañera de PTFE 1/16 &quot;ing en trozos de 4-5 cm de longitud; estos serán los manguitos utilizados en las uniones capilares para proporcionar una conexión libre de fugas. </li><li> Conectar el extremo opuesto de la 100 micras ID x 360 micras OD capilar a una unión PEEK; utilizar un manguito de 1/32 &quot;PEEK para proporcionar una conexión libre de fugas. </li><li> Insertar / apretar un pedazo de ~ 5 cm de largo tubo de PTFE 1/16 &quot;en el extremo opuesto de la unión. </li><li> Pesar ~ 4 mg de C18 (5 micras) partículas en un pre-limpiado / secado 2 ml vial de vidrio; añadir 0,5 ml de isopropanol, cerrar el vial y dispersar la suspensión en el baño de ultrasonidos. </li><li> Retirar con una jeringa de 250 l, aproximadamente 200 l de suspensión, insertar la aguja de la jeringa en el &quot;tubo de PTFE 1/16 de la unión PEEK, y dispensar lentamente la suspensión en el 100 micras DI x 360 micras capilar OD; observar bajo el microscopio como el capilar se llena con partículas de hasta una longitud de mm embalaje 2-3 se consigue, lo que será el microrreactor (Figura 1) el 20 μ.capilar m Identificación retiene las partículas en el micro-reactor a través de un efecto de distorsión trapezoidal. 15 </li><li> Enjuague el micro-reactor con solución de ~ 50 l de H2O / CH3CN 50:50 v / v, y luego con solución de ~ 50 l de H2O / CH3CN 98: 2 v / v. </li></ol> 2. Preparación de las soluciones de muestra Nota: Las operaciones que impliquen la manipulación de disolventes y ácidos orgánicos y preparación de la solución se van a realizar en una campana extractora. Llevar gafas, guantes y ropa de protección. <ol><li> Enjuague con CH 3 OH y secar unos viales de vidrio (4 ml) y los tubos de polipropileno (15 ml). </li><li> Preparar 10 ml de una solución de H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) en un tubo de 15 ml de polipropileno por mezcla de 9,8 ml de H 2 O con 200 l CH 3 CN; mezclar mediante ultrasonidos. </li><li> Preparar 10 ml de una solución de H 2 O / CH 3 CN (50:50 v / v) en un tubo de 15 ml de polipropileno por mezcla de 5 ml H 2 &lt;/ sub&gt; O con 5 ml de CH3CN; mezclar mediante ultrasonidos. </li><li> Preparar 4 ml de una solución acuosa acidificada (TFA 0,01% v / v) mediante la adición de 4 l de TFA (10%) a 4 ml H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) en un vial de vidrio de 4 ml; mezclar mediante ultrasonidos. </li><li> Preparar 4 ml de una solución orgánica acidificada (TFA 0,01% v / v) mediante la adición de 4 l de TFA (10%) a 4 ml H 2 O / CH 3 CN (50:50 v / v) en un vial de vidrio de 4 ml; mezclar mediante ultrasonidos. </li><li> Pesar 16 mg NH 4 HCO 3 con una microbalanza analítica en un vial de vidrio de 4 ml; añadir 4 ml de la H 2 O / CH 3 CN: solución (98 / v 2 v) y se dispersan por sonicación; esto se traduce en una solución 50 mM de NH 4 HCO 3 (pH ~ 7,8) en tampón acuoso. </li><li> Pesar 5 mg de una proteína estándar (por ejemplo, albúmina de suero bovino, la hemoglobina α / β, el citocromo C, anhidrasa carbónica, α-2-HS-glicoproteína, etc.) con una microbalanza analítica en un vial de vidrio de 4 ml; añadir 4 ml finales de DIr y dispersar por sonicación; esto típicamente resulta en una solución de concentración de alto nivel M. </li><li> Preparar 1 ml de solución de proteína (1-2 M) diluyendo la solución de concentración de alto nivel mu M con un volumen apropiado de NH 4 HCO 3 (50 mM) de tampón acuoso; mezclar mediante ultrasonidos. </li><li> Preparar la solución de tripsina (5 mM) disolviendo 20 g de tripsina de secuenciación grado en 170 l NH 4 HCO 3 (50 mM) de tampón acuoso; dispersar mediante ultrasonidos. </li></ol> 3. Configuración Experimental Nota: El sistema LTQ-MS está provisto de una fuente ESI modificado que incluye una casa construida XYZ-etapa que permite la interconexión del espectrómetro de masas a diversos enfoques de entrada de muestra. <ol><li> Desconectar el capilar micro-reactor de la unión PEEK y PEEK conectarse a la camiseta. </li><li> Inserte el cable a ~ 2 cm de largo Pt en el brazo lateral del PEEK T; utilizar un &quot;manga 1/32 PEEK para proporcionar unaLibre de fugas y conexiones para el aislamiento del alambre de Pt. </li><li> Conectar un 50 micras ID x 360 micras OD (~ 0,5 m de largo) de transferencia de muestras capilar en el extremo opuesto de la PEEK Tee; utilizar un manguito de 1/32 &quot;PEEK para proporcionar una conexión libre de fugas. </li><li> Asegurar el Tee PEEK en el XYZ-etapa y la posición del emisor ESI ~ 2 mm de distancia del capilar de entrada de espectrómetro de masas. </li><li> Conectar el cable de Pt a la fuente de alimentación ESI del espectrómetro de masas. </li><li> Conectar el extremo opuesto del capilar de transferencia de muestra a la unión de acero inoxidable; utilizar un manguito de 1/16 &quot;PEEK para proporcionar una conexión libre de fugas. </li><li> Conectar un 4-5 cm de largo tubo de PTFE 1/16 &quot;hasta el extremo opuesto de la unión de acero inoxidable e inserte la aguja de la jeringa 250 l en el tubo de PTFE; encender la bomba y ajustar el caudal al valor deseado (por ejemplo, 2 l / min). </li><li> parámetros de adquisición de datos de MS en tándem de entrada en el paquete de software que controla el instrumento EMd guardar como un archivo de método para preparar la instalación para la realización del análisis; para el sistema LTQ-EM, utilice los parámetros de análisis de datos dependientes siguientes: dinámica de exclusión habilitado para 180 seg con un ancho de masas exclusión ± 1,5 m / z; uno miembros de exploración seguido de uno de zoom y MS 2 scans en los 5 primeros picos más intensos, zoom ancho de barrido ± 5 m / z; la disociación inducida por colisión (CID) los parámetros establecidos en el ancho de separación de 3 m / z, la energía de colisión normalizada del 35%, la activación Q 0.25, y el tiempo de activación de 30 ms. </li></ol> 4. Configuración de microfluidos <ol><li> Preparar un dispositivo microfluídico de vidrio o sustratos poliméricos; 16-18 el diseño del dispositivo se proporciona en la Figura 2A, que consiste en un microrreactor (1) (0,13 mm de ancho x 2 mm de longitud x 50 m de profundidad) conectado a una entrada (2 ), salida (3) y un puerto lateral (4); los canales de interconexión para manipulaciones de fluidos son ~110 micras de ancho y 50 m de profundidad ~; una estructura de múltiples canales (5), que consta de ~ 1,5 a 2 micras de profundidad x 10 m de ancho x 100 micras microcanales largos colocados 25 m de distancia, actuará como un filtro para retener las partículas en el microrreactor. </li><li> Habilitar conexiones de fluidos a la entrega al chip por encolado conectores especializados a los puertos de entrada, o mediante la elaboración de un soporte polimérico que tiene capacidad para accesorios de suministro de fluido (Figura 2B). 16 </li><li> Preparar una suspensión de partículas C18 (5 micras) tal como se describe en el paso 1.8; entregar la suspensión para el microrreactor con una jeringa mediante el uso de 1/16 &quot;tubo de PTFE conectado al puerto de lado de chip (4); sellar el puerto después de la carga de partículas con pegamento epoxi y cura para 1 hr en un horno a 90 ºC 16. </li><li> Inserte un capilar (20 micras x 90 micras ID DE x 10 mm de longitud) en el orificio de salida, sellar con pegamento E6000, y curemos O / N; esto se convertirá en el emisor ESI ( <strong&gt; 6). </li><li> Conectar un 50 micras ID x 360 OD m (~ 0,5 m de largo) de transferencia de muestras capilar al puerto de entrada de chip (2); conectar el extremo opuesto del tubo capilar a una jeringa de 250 l y la bomba de jeringa, como se describe en 3.6 a 3.7. </li><li> Colocar un peso ligero PEEK Tee conector de la línea de transferencia de muestra justo antes de la abertura de entrada (2) e insertar un alambre de Pt en el lado del brazo de la T, como se describe en 3.2; este será el electrodo ESI. </li><li> Fijar el dispositivo de microfluidos en el escenario XYZ con el emisor ESI posicionado ~ 2 mm de distancia del capilar de entrada de espectrómetro de masas; preparar el MS para el análisis como se describe en 3.8. </li></ol> 5. Carga de la muestra, de digestión proteolítica y elución para MS Análisis Nota: Todos los pasos de transferencia de solución / muestra se llevan a cabo con la ayuda de una bomba de jeringa y debe permitir por unos minutos adicionales para completar, para compensar los muertos-volumES asociados a las líneas de transferencia desde y hacia el micro-reactor; el tiempo necesario dependerá de las velocidades de flujo implicadas. <ol><li> Enjuague el microrreactor y prepararlo para el análisis mediante la infusión de una solución acuosa de NH 4 HCO 3 (50 mM) en H2O / CH3CN (98: 2 v / v) a 2 l / min durante 5 min; utilizar una jeringa de 250 microlitros. </li><li> Cargar la muestra de proteína (1 M) en el microreactor mediante la infusión de la solución de muestra a 2 l / min durante 5 min; utilizar una jeringa de 250 microlitros. </li><li> Infundir la solución de tripsina (5 mM) sobre la proteína adsorbida en el microrreactor a 2 l / min para 1-3 min. </li><li> Se detiene el proceso de digestión proteolítica enjuagando el microrreactor con una solución acuosa acidificada de TFA (0,01% v / v) en H 2 O / CH 3 CN (98: 2 v / v) a 2 l / min durante 5 min; utilizar una jeringa de 250 microlitros. </li><li> Iniciar la elución de la proteína digerir del microrreactor mediante la infusión de una solución orgánica acidificada de TFA (0,01%v / v) en H 2 O / CH 3 CN (50:50 v / v) a 300 nl / min. </li><li> Encienda el proceso de adquisición de datos de MS y la tensión de ESI (~ 2.000 V); adquirir datos de MS utilizando los parámetros de adquisición de los datos proporcionados en el paso 3.8; observar la elución de los péptidos trípticos. </li></ol> 6. Proceso de Datos <ol><li> Procesar los datos de MS en tándem con un motor de búsqueda compatible con el formato de datos MS prima. <ol><li> Procesar los archivos RAW LTQ-MS utilizando un organismo específico de la base de datos de proteínas mínimamente redundante; cargar los datos en bruto en el motor de búsqueda, establecer los límites de tolerancia de masa de los padres y de iones fragmento a 2 y 1 Da, respectivamente, y el uso de fragmentos única plenamente tríptico con hasta dos divisiones perdidas para la búsqueda; no permiten modificaciones posteriores a la traducción; establecer las tasas de descubrimiento de alta y media confianza falsos (FDR) a 1% y 3%, respectivamente, y no permiten modificaciones posteriores a la traducción. </li></ol></li><li> Filtrar los datos para seleccionar únicos de alta confianzapéptido coincide con las proteínas en la base de datos; evaluar la proteína y a nivel de péptido resultados. </li></ol>

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The authors declare no competing financial interests.

El micro-reactor descrito en este trabajo proporciona una forma fácil de implementar montaje experimental para llevar a cabo la digestión enzimática de las proteínas para permitir el análisis de MS y la identificación en menos de 30 minutos. Las ventajas de este sistema, en comparación con los enfoques convencionales, incluyen la simplicidad, velocidad, bajo consumo de reactivo y bajos costos. En particular, no hay necesidad de perlas de tripsina inmovilizada caros y cartuchos. La preparación del microrreactor capilar es sencillo (Figura 1A), y se puede lograr dentro de minutos de alimentación estándar, se encuentran comúnmente en un laboratorio de cromatografía. Mientras que las partículas C18 fase inversa pueden ser enjuagados con disolvente orgánico de alto contenido (CH 3 CN o CH 3 OH) para completar la eliminación de las proteínas adsorbidas o péptidos, y el microrreactor se pueden volver a utilizar, el proceso de fabricación fácil y rentable invita a la fabricación de unidades desechables para un solo uso aplicciones. El microrreactor capilar se puede montar en una fuente ESI construido en casa, como se muestra en la Figura 1B, o puede ser insertado en una fuente de iones comercial estándar. Mientras que el lecho de partículas para la captura y digestión de la muestra no necesita ser superior a ~ 1-2 mm, lo suficiente para capturar el material suficiente para la detección óptima por MS, la longitud de la propia capilar se puede ajustar para adaptarse al tamaño de cualquier particular, fuente de iones. Para los laboratorios que tienen capacidades para fabricar dispositivos microfluídicos, se proporciona un diseño simple (Figura 2A) que se puede asegurar en un soporte para facilitar la interfaz con MS de detección (Figura 2B). Las dimensiones de los canales de transferencia microreactor y se pueden ajustar a los requisitos de una aplicación particular, y el dispositivo se pueden desarrollar en un formato simple o multiplexado. Para la mayoría de los espectrómetros de masas comerciales, sin embargo, la fuente de iones necesitaría modificaciones para permitir THe la colocación del dispositivo en la fuente. El dibujo fotomáscara para la fabricación de chips se ejecutó con el software AutoCAD y la fotomáscara fueron preparados por la ETS fotomáscara. La fabricación de los microchips se realizó de acuerdo a los protocolos descritos anteriormente: 17,18 alineación del sustrato con la fotomáscara, exposición a la luz UV (360 nm), la eliminación del fotoprotector irradiado y capa de cromo subyacente, grabado químico húmedo de canales con tampón etch óxido, la eliminación de la capa de cromo restante, la perforación de orificios de acceso, la limpieza, la hidrólisis de la superficie microchip (NH 4 OH + H 2 O 2), y la unión térmica del sustrato a la placa de cubierta por calentamiento gradual a 550 ºC. Tanto la placa de sustrato y la cubierta fueron grabadas, una para los canales profundos para el manejo de la muestra (~ 20-50 micras), y el otro para los elementos de filtro de micro-canal poco profundo (1,5-2 micras de profundidad). 16 Los resultados generados con el mi-descrita anteriormentecroreactor son comparables con los resultados obtenidos a partir de O / N, 19 protocolos de digestión convencionales que utilizan sustrato: relaciones enzimáticas de (50-100): 1, seguido por un experimento de infusión péptido con MS de detección (300 nl / min, los péptidos se disolvió en H (50:50 v / v) se acidificó con CH 3 COOH, 0,1% v / v). 2 O / CH 3 CN Tanto micro-reactor y protocolos convencionales permitieron la identificación de todas las proteínas de múltiples péptidos únicos (Tabla 1). Por lo general, un número algo mayor de péptidos únicos por proteínas eran observables con el micro-reactor que con la configuración convencional. Este fue un resultado de la escisión enzimática incompleta en ciertos sitios. A los pocos minutos adicionales de la digestión proteolítica reducen o eliminan este resultado. También, algunos péptidos enzimáticos generados con el microrreactor diferían de los generados en solución, debido al hecho de que para las proteínas adsorbidas sobre las partículas de C18 diferentes sitios fueron expuestos a la enzima tHan en soluciones homogéneas. 20 Las puntuaciones Xcorr demuestran, sin embargo, que la calidad de los espectros de masas en tándem generado con el microreactor era de alta calidad, y que una cobertura suficiente de secuencias de proteínas (11-75%) es alcanzable para la identificación de proteínas sin ambigüedades . La técnica, como se describe, se limita al análisis de mezclas de proteínas bastante simples que generan en la mayoría de ~ 25-50 péptidos que pueden ser analizados por los experimentos de infusión simples y que no requieren separación de cromatografía de líquidos antes del análisis MS. Crítica para el éxito es el uso de soluciones de tripsina recién descongeladas y preparados, a no reducir o perder la actividad de la enzima proteolítica en el pH operativo de la microrreactor (es decir, pH ~ 8). Además, un equilibrio adecuado se debe encontrar entre las tasas óptimas de flujo para la ionización por electrospray (150-300 nl / min) y las velocidades de flujo máximas que pueden ser toleradas por la configuración experimental y que permitenrápida elución péptido de la microrreactor (2-3 l / min). Mayores que las tasas óptimas de flujo ESI resultar en pérdidas de sensibilidad y límites de detección pobres. Como resultado, la longitud de los capilares de transferencia debe mantenerse lo más corto posible para reducir el tiempo necesario para la elución de los péptidos de la microrreactor cuando se opera a ≤300 nl / min. Todos los componentes que se utilizaron para la configuración experimental puede ser reemplazado por componentes de otros fabricantes que realizan funciones similares. Si las características dimensionales de estos componentes difieren (longitud, diámetro, volumen), la optimización de las tasas de flujo de eluyente, concentración de la muestra, el tiempo para llevar a cabo ciertos pasos y de la tensión de ESI puede ser necesaria para obtener resultados similares. Una ventaja única habilitada por la configuración de microfluidos es la capacidad de incorporar además en el chip de un sistema de bombeo, por ejemplo, una bomba de flujo electroosmótico impulsado, 21,22 para permitir que el stand-aluna operación de la plataforma y la integración de una etapa de separación adicional. La capacidad de realizar separaciones en el chip de los péptidos generados a través de la digestión proteolítica resultará en límites de detección mejorados, y facilitará el análisis de mezclas complejas de proteínas a partir de extractos celulares. Esto permitirá la integración de la técnica en los flujos de trabajo que hacen uso de plataformas microfabricados y detección MS de alta velocidad para aplicaciones biomédicas. 23

La identificación y caracterización de las proteínas purificadas se consigue frecuentemente mediante el uso de técnicas de EM. La proteína se digiere con una enzima y sus péptidos se analizan además por MS mediante una sencilla configuración experimental de infusión. La digestión proteolítica es necesaria para la generación de pequeños fragmentos de péptidos que se encuentran en el rango de masa útil de la mayoría de los analizadores de MS, y que puede ser fácilmente fragmentado a través de baja energía de disociación inducida por colisión para generar información de la secuencia de aminoácidos. Para las proteínas aisladas o mezclas de proteínas simples, no hay más necesidad de la separación cromatográfica de péptidos antes de la detección EM. Una mezcla de 25-50 péptidos se puede analizar fácilmente mediante la infusión de la muestra con una bomba de jeringa directamente en la fuente de MS de iones. El espectrómetro de masas puede llevar a cabo el análisis y confirmar la secuencia de una proteína en un breve espacio de tiempo. Con los métodos de adquisición de datos modernos, este proceso puede llevarse a cabo wentro de unos minutos o incluso segundos. El factor limitante en la realización de todo el proceso en una corta escala de tiempo es la etapa de digestión proteolítica. Por lo general, esto se realiza a través de un par de horas (o S / N), en solución, a 37 ºC, usando sustrato: proporciones de enzimas (50-100): 1. Para reducir el tiempo de digestión enzimática para minutos o segundos, microrreactores enzima inmovilizada, en forma de reactores de microfluidos o cartuchos disponibles en el mercado, se han descrito. 1-6 Típicamente, la enzima se inmoviliza por covalente, no covalente de adsorción / física, complejo la formación o la encapsulación, 3,6 la eficiencia mejorada del proceso enzimático ser habilitado por la gran superficie a volumen y las proporciones de enzima a sustrato. Otras ventajas de los reactores inmovilizados incluyen la autólisis y la interferencia reducidos de la enzima en el análisis de MS, la mejora de la estabilidad de la enzima y la reutilización. Se ha descrito una variedad de enfoques, el uso de vidrio o dispositivos microfabricados poliméricos,el uso de enzimas inmovilizadas sobre perlas magnéticas por las interacciones antígeno-anticuerpo, 7,8 atrapados en las redes de nanopartículas de oro, 9 encapsulado en titania-alúmina sol-geles 10 y nanozeolites, 11 o capturados a través de Ni-NTA o His-Tag la formación del complejo. 6 Alternativamente , se han desarrollado capilares abiertos-tubulares con enzimas inmovilizadas, también. 12 por otra parte, el aumento de la escisión proteolítica se ha demostrado mediante el uso de irradiación de microondas controlado 13 o tecnología bicicleta asistida por presión o presión (PCT) para la reducción de los tiempos de reacción a 30-120 min. 14 A pesar de las múltiples ventajas de los reactores de enzimas inmovilizados, los costos de los cartuchos comerciales es alta, la disponibilidad de dispositivos de microfluidos para uso rutinario es limitado, y el uso de los resultados de tecnologías de microondas o PCT en necesidad de instrumentación adicional. El objetivo de este trabajo fue desarrollar un método que circumveNTS estas desventajas, y que se puede implementar fácilmente en cada laboratorio para capacitar a los investigadores un método sencillo y eficaz para llevar a cabo la escisión enzimática de las proteínas en la preparación para el análisis de MS en cuestión de minutos. El enfoque se basa en el uso de hidrófobos, C18-partículas que son pre-cargados en un capilar o un dispositivo de microfluidos, y la adsorción de la proteína (s) de interés en estas partículas, seguido por digestión enzimática durante la infusión de la enzima sobre el lecho compacto y proteína (s) capturada. En este enfoque, el sustrato se inmoviliza a través de interacciones no covalentes, y la enzima se infunde a través de la proteína inmovilizada. La eficiencia de la digestión proteolítica se incrementa por las grandes áreas de superficie de partículas que exponen a la proteína para el procesamiento enzimático, distancias y tiempos de difusión hacia y desde la superficie de partículas reducido, una mejor transferencia de masa, no unión covalente que pueden afectar a la actividad de la enzima, la capacidad de forma rápida evaluate combinaciones de diferentes enzimas, disponibilidad de acceso, y la multiplexación si el proceso se ejecuta en un formato de microfluidos. Este enfoque se demuestra con el uso de una mezcla de proteínas estándar y de tipo tripsina de la enzima más utilizada para la digestión proteolítica antes de la detección ESI-MS. El espectrómetro de masas utilizado para la detección en este estudio fue un instrumento lineal trampa cuadrupolo (LTQ).

<table><tbody><tr><td>Ion trap ESI-MS</td><td>Thermo Electron</td><td>LTQ</td><td>The LTQ mass spectrometer is used for acquiring tandem MS data</td></tr><tr><td>XYZ stage</td><td>Newport</td><td>Multiple parts</td><td>The home-built XYZ stage is used to adapt the commercial LTQ nano-ESI source to receive input from various sample delivery systems</td></tr><tr><td>Stereo microscope</td><td>Edmund optics</td><td>G81-278</td><td>The microscope is used to observe the microreactor packing process</td></tr><tr><td>Analytical balance/Metler</td><td>VWR</td><td>46600-204</td><td>The balance is used to weigh the protein samples</td></tr><tr><td>Ultrasonic bath/Branson</td><td>VWR</td><td>33995-540</td><td>The sonic bath is used for mixing/homogenizing the samples and dispersing the C18 particle slurry</td></tr><tr><td>Syringe pump 22</td><td>Harvard Apparatus</td><td>552222</td><td>The micropump is used for loading, rinsing and eluting the sample and the enzyme on and from the packed capillary microreactor</td></tr><tr><td>Milli-Q ultrapure water system</td><td>EMD Millipore</td><td>ZD5311595&amp;nbsp;</td><td>The MilliQ water system is used to prepare purified DI water</td></tr><tr><td>Pipettor/Eppendorf (1,000&amp;nbsp;&amp;micro;l)</td><td>VWR</td><td>53513-410</td><td>The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions</td></tr><tr><td>Pipettor/Eppendorf (100&amp;nbsp;&amp;micro;l)</td><td>VWR</td><td>53513-406</td><td>The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions</td></tr><tr><td>Pipettor/Eppendorf (10&amp;nbsp;&amp;micro;l)</td><td>VWR</td><td>53513-402</td><td>The pipettor is used to measure small volumes of sample solutions</td></tr><tr><td>Fused silica capillary (100 &amp;micro;m ID x 360 &amp;micro;m OD)</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP100375</td><td>This capillary is used for the fabrication of the microreactor</td></tr><tr><td>Fused silica capillary (20&amp;nbsp;&amp;micro;m ID x 100 &amp;micro;m OD)</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP020090</td><td>This capillary is used for the fabrication of the ESI emitter</td></tr><tr><td>Fused silica capillary (50&amp;nbsp;&amp;micro;m ID x 360 &amp;micro;m OD)</td><td>Polymicro Technologies</td><td>TSP050375</td><td>This capillary is used to transfer the samples and the eluent from the syringe pump to the capillary microreactor</td></tr><tr><td>Glass capillary cleaver</td><td>Supelco</td><td>23740-U</td><td>This is a tool for cutting fused silica capillaries at the desired length</td></tr><tr><td>Glue</td><td>Eclectic Products</td><td>E6000 Craft</td><td>This glue is used for securing the ESI emitter into the capillary microreactor or the microfluidic chip</td></tr><tr><td>Epoxy glue</td><td>Epo-Tek</td><td>353NDT</td><td>This glue is used to seal the microfluidic inlet hole through which the C18 particles are loaded</td></tr><tr><td>Reversed phase C18 particles (5&amp;nbsp;&amp;micro;m)</td><td>Agilent Technologies</td><td>Zorbax 300SB-C18</td><td>These are C18 particles on which the proteins are adsorbed; the particles were extracted from a 4&amp;nbsp;mm x 20 cm C18 LC column from Agilent</td></tr><tr><td>Syringe/glass (250 &amp;micro;l)</td><td>Hamilton</td><td>81130-1725RN</td><td>The glass syringes are used to load the C18 particle slurry in the capillary microreactor and to deliver the sample and eluents to the microreactor</td></tr><tr><td>Internal reducing PEEK Union (1/16&amp;rdquo; to 1/32&amp;rdquo;)</td><td>Valco</td><td>ZRU1.5FPK</td><td>This union is used to connect the 250 &amp;micro;l syringe to the microreactor for loading the 5 &amp;micro;m particle slurry</td></tr><tr><td>Stainless steel union (1/16&amp;rdquo;)</td><td>Valco</td><td>ZU1XC</td><td>The stainless steel union is used to connect the glass syringe needle to the infusion capillary</td></tr><tr><td>Microvolume PEEK Tee connector (1/32&amp;rdquo;)</td><td>Valco</td><td>MT.5XCPK</td><td>The Peek tee is used to connect the sample transfer capillary to the capillary microreactor; on its side arm, it enables the insertion of the Pt wire</td></tr><tr><td>Tee connector (light weight)</td><td>Valco</td><td>C-NTXFPK</td><td>This Tee connector is used to apply ESI voltage to the microfluidic chip through the sample transfer line</td></tr><tr><td>Pt wire (0.404 mm)</td><td>VWR</td><td>66260-126</td><td>The Pt wire provides electrical connection for ESI generation and is connected to the mass spectrometer ESI power supply</td></tr><tr><td>PTFE tubing (1/16&amp;rdquo; OD)</td><td>Valco</td><td>TTF115-10FT</td><td>The Teflon tubing is used to enable an air-tight connection between the syringe needle and the stainless steel union&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PEEK tubing (0.015&amp;rdquo; ID x 1/16&amp;rdquo; OD)</td><td>Upchurch Scientific</td><td>1565</td><td>The Peek tubing is used as a sleeve to enable an air-tight connection between the stainless steel union and the 50&amp;nbsp;&amp;micro;m ID transfer capillary</td></tr><tr><td>PEEK tubing (0.015&amp;rdquo; ID x 1/32&amp;rdquo; OD)</td><td>Valco</td><td>TPK.515-25</td><td>The Peek tubing is used as a sleeve to enable a leak-free connection between the fused silica capillaries and the Peek Tee</td></tr><tr><td>Clean-cut polymer tubing cutter</td><td>Valco</td><td>JR-797</td><td>This cutter is used to pre-cut the 1/16&amp;rdquo; and 1/32&amp;rsquo; Peek polymer tubing that is used as sleeve for leak-free connections in pieces of ~4-5 cm in length</td></tr><tr><td>Amber vial (2 ml)</td><td>Agilent&amp;nbsp;</td><td>HP-5183-2069</td><td>The vials are used to prepare sample solutions and the C18 particle slurry&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Amber vial (4 ml)</td><td>VWR</td><td>66011-948</td><td>The vials are used to prepare sample solutions</td></tr><tr><td>Polypropylene tube (15&amp;nbsp;ml)</td><td>Fisher</td><td>12-565-286D</td><td>The vials are used to prepare buffer solutions</td></tr><tr><td>Cylinder (100 ml)</td><td>VWR</td><td>24710-463</td><td>The cylinder is used to measure volumes of solvent</td></tr><tr><td>Cylinder (10 ml)</td><td>VWR</td><td>24710-441</td><td>The cylinder is used to measure volumes of solvent</td></tr><tr><td>Pipette tips (1,000 &amp;micro;l)</td><td>VWR</td><td>83007-386</td><td>The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions</td></tr><tr><td>Pipette tips (100 &amp;micro;l)</td><td>VWR</td><td>53503-781</td><td>The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions</td></tr><tr><td>Pipette tips (10 &amp;micro;l)</td><td>VWR</td><td>53511-681</td><td>The pipette tips are used to measure small volumes of sample solutions</td></tr><tr><td>Glass substrates</td><td>Nanofilm</td><td>B270 white crown, 3&amp;rdquo; x 3&amp;rdquo;</td><td>These are glass substrates for microchip fabrication</td></tr><tr><td>Male nut fitting (1/16&amp;rdquo;)</td><td>Upchurch</td><td>P203X</td><td>This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip</td></tr><tr><td>Nanoport assembly</td><td>Upchurch</td><td>N-122H</td><td>This fitting is used for connecting transfer capillaries to the microfluidic chip</td></tr><tr><td>Protein standards</td><td>Sigma</td><td>Multiple #</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile, HPLC grade</td><td>Fisher</td><td>A955</td><td></td></tr><tr><td>Methanol, HPLC grade</td><td>Fisher</td><td>A452</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol, HPLC grade</td><td>Sigma</td><td>650447</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Sigma</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium bicarbonate</td><td>Aldrich</td><td>A6141</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin, sequencing grade</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr></tbody></table>

fast enzymatic processing of proteins for ms detection with a flow-through microreactor

La gran mayoría de la espectrometría de masas (MS) a base de los métodos de análisis de proteínas implican una etapa de digestión enzimática antes de la detección, por lo general con tripsina. Este paso es necesario para la generación de péptidos de bajo peso molecular, generalmente con MW &lt;3.000-4.000 Da, que caen dentro del rango de escaneado efectivo de la instrumentación de espectrometría de masas. protocolos convencionales implican la digestión enzimática O / N a 37 ºC. Los avances recientes han llevado al desarrollo de una variedad de estrategias, típicamente implica el uso de un microrreactor con enzimas inmovilizadas o de una serie de procesos físicos complementarios que reducen el tiempo necesario para la digestión proteolítica a unos pocos minutos (por ejemplo, de microondas o de alta presión). En este trabajo se describe un método sencillo y rentable que puede ser implementado en cualquier laboratorio para lograr la rápida digestión enzimática de una proteína. La proteína (o mezcla de proteínas) se adsorbe en alta perf de fase inversa C18-unidoormance partículas de sílice líquidos cromatografía (HPLC) precargados en una columna capilar, y tripsina en tampón acuoso se infunde a través de las partículas para un corto período de tiempo. Para habilitar la detección MS en línea, los péptidos trípticos se eluyen con un sistema disolvente con el aumento de contenido orgánico directamente en la fuente de MS de iones. Este enfoque evita el uso de partículas de alto precio enzima inmovilizada y no necesita ninguna ayuda para completar el proceso. La digestión de proteínas y análisis de la muestra completa se puede lograr en menos de 3 min y ~ ~ 30 min, respectivamente.

Un resultado representativo de un proceso de digestión proteolítica lleva a cabo de forma simultánea en una mezcla de proteínas, con los microrreactores descritos anteriormente (Figuras 1 o 2), se proporciona en la Tabla 1. La tabla comprende las secuencias de péptidos únicos que identifican una proteína particular, la cruz puntuación de correlación (Xcorr) (es decir, una puntuación que caracteriza la calidad del partido-experimental para teórica para el espectro de masas en tándem correspondiente), el número de divisiones perdidas, el estado de carga de péptidos (z), y la masa / carga ( m / z) de los péptidos protonadas. A nivel de proteínas, la tabla proporciona el ID de proteínas UniProt, la descripción (nombre) de la proteína, la puntuación de la proteína y la cobertura de la proteína. Todas las proteínas eran identificables por múltiples péptidos, después de una digestión proteolítica lleva a cabo durante 90 segundos. El tiempo necesario para laelución de todos los péptidos era dependiente de la longitud del capilar de transferencia que entrega la solución orgánica se acidificó a 300 nl / min, una velocidad de flujo compatible con nano-ESI funcionamiento óptimo. En capilar mezcla de las soluciones acuosas y orgánicas acidificadas dio como resultado la elución temprana de algunos péptidos, pero la gran mayoría se eluyó durante varios minutos sólo en la solución orgánica. Un espectro de masas muestra el co-elución de varios péptidos representativos de las cinco proteínas, generados con el microrreactor capilar, se proporciona en la Figura 3. Tabla 1. Lista de péptidos trípticos generados a través de la digestión proteolítica de cinco proteínas utilizando el micro-reactor capilar y protocolos de digestión O / N. Sólo secuencias únicas, con la más alta Xcorr, se muestran. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53564/53564table1.xlsx" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.</a> </a&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53564/53564fig1.jpg" /> Figura 1. capilar microrreactor. (A) Montaje experimental para la fabricación de la microrreactor. (B) capilar micro-reactor posicionado en la fuente de iones MS. El micro-reactor se carga manualmente con partículas de sílice unidos a C18 y se coloca en un XYZ-etapa que facilita el posicionamiento adecuado en la fuente ESI-MS. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53564/53564fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53564/53564fig2.jpg" /> Figura 2. microrreactor de microfluidos. (A) Diagrama esquemático del reactor de microfluidos. (B) del reactor de microfluidos asegurado en un soporte PEEK. El reactor de microfluidos unand líneas de transferencia se fabrican en un sustrato de vidrio que se puede fijar en una PEEK polimérico de fabricación casera de pie para su posterior colocación en la fuente MS con la etapa de XYZ. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53564/53564fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/53564/53564fig3highres.jpg" width="700" /> Figura 3. Espectro de masas que comprende péptidos trípticos generados a partir de la mezcla de proteínas sometidas a proteolisis en el micro-reactor. Los iones más intensos de péptidos trípticos se etiquetan con la secuencia de los aminoácidos y el correspondiente identificador de proteínas. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53564/53564fig3highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Fast Enzymatic Processing of Proteins for MS Detection with a Flow-through Microreactor

Tratamiento enzimático rápido de proteínas para la detección MS con un microrreactor de flujo continuo

A quick protocol for proteolytic digestion with an in-house built flow-through tryptic microreactor coupled to an electrospray ionization (ESI) mass spectrometer is presented. The fabrication of the microreactor, the experimental setup and the data acquisition process are described.

The vast majority of mass spectrometry (MS)-based protein analysis methods involve an enzymatic digestion step prior to detection, typically with trypsin. ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.9K vistas.  Virginia Tech. A quick protocol for proteolytic digestion with an in-house built flow-through tryptic microreactor coupled to an electrospray ionization (ESI) mass spectrometer is presented. The fabrication of the microreactor, the experimental setup and the data acquisition process are described.

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Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. Hydrogen-Deuterium Exchange (HDX) measured at rapid time scales is uniquely suited to detect structures and hydrogen bonding networks that are briefly populated, allowing for the characterization of transient conformers in native ensembles. Coupling of HDX to mass spectrometry offers several key advantages, including high sensitivity, low sample consumption and no restriction on protein size. This technique has advanced greatly in the last several decades, including the ability to monitor HDX labeling times on the millisecond time scale. In addition, by incorporating the HDX workflow onto a microfluidic platform housing an acidic protease microreactor, we are able to localize dynamic properties at the peptide level. In this study, Time-Resolved ElectroSpray Ionization Mass Spectrometry (TRESI-MS) coupled to HDX was used to provide a detailed picture of residual structure in the tau protein, as well as the conformational shifts induced upon hyperphosphorylation.

Conformational flexibility plays a critical role in protein function. Herein, we describe the use of time-resolved electrospray ionization mass spectrometry coupled to hydrogen-deuterium exchange for probing the rapid structural changes that drive function in ordered and disordered proteins.

Resuelta en el tiempo de ionización por electrospray de hidrógeno-deuterio Espectrometría de Masas de cambio para el estudio de la estructura proteica y Dinámica

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Investigación

Bioquímica

Real-time Monitoring of Reactions Performed Using Continuous-flow Processing: The Preparation of 3-Acetylcoumarin as an Example

By using inline monitoring, it is possible to optimize reactions performed using continuous-flow processing in a simple and rapid way. It is also possible to ensure consistent product quality over time using this technique. We here show how to interface a commercially available flow unit with a Raman spectrometer. The Raman flow cell is placed after the back-pressure regulator, meaning that it can be operated at atmospheric pressure. In addition, the fact that the product stream passes through a length of tubing before entering the flow cell means that the material is at RT. It is important that the spectra are acquired under isothermal conditions since Raman signal intensity is temperature dependent. Having assembled the apparatus, we then show how to monitor a chemical reaction, the piperidine-catalyzed synthesis of 3-acetylcoumarin from salicylaldehyde and ethyl acetoacetate being used as an example. The reaction can be performed over a range of flow rates and temperatures, the in-situ monitoring tool being used to optimize conditions simply and easily.

Real-time monitoring allows for fast optimization of reactions performed using continuous-flow processing. Here the preparation of 3-acetylcoumarin is used as an example. The apparatus for performing in-situ Raman monitoring is described, as are the steps required to optimize the reaction.

Monitoreo en tiempo real de reacciones realizadas Utilizando Procesamiento de flujo continuo: La Preparación de 3-Acetylcoumarin como ejemplo

By using inline monitoring, it is possible to optimize reactions performed using continuous-flow processing in a simple and rapid way. It is also possible ...

Química

A Simple Fractionated Extraction Method for the Comprehensive Analysis of Metabolites, Lipids, and Proteins from a Single Sample

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually determined by transcriptomic, proteomic, metabolomics and lipidomic measurements. In this protocol, we introduce a simple method for the reproducible extraction of metabolites, lipids and proteins from biological tissues using a single aliquot per sample. The extraction method is based on a methyl tert-butyl ether: methanol: water system for liquid: liquid partitioning of hydrophobic and polar metabolites into two immiscible phases along with the precipitation of proteins and other macromolecules as a solid pellet. This method, therefore, provides three different fractions of specific molecular composition, which are fully compatible with common high throughput 'omics' technologies such as liquid chromatography (LC) or gas chromatography (GC) coupled to mass spectrometers. Even though the method was initially developed for the analysis of different plant tissue samples, it has proved to be fully compatible for the extraction and analysis of biological samples from systems as diverse as algae, insects, and mammalian tissues and cell cultures.

A protocol for comprehensive extraction of lipids, metabolites and proteins from biological tissues using one sample is presented.

Un método de extracción fraccionada simple para el análisis comprensivo de metabolitos, lípidos y proteínas a partir de una sola muestra

Understanding of complex biological systems requires the measurement, analysis and integration of multiple compound classes of the living cell, usually ...

Microfluidic Mixers for Studying Protein Folding

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason for this is that folding takes place over a wide range of timescales, from nanoseconds to seconds or longer, depending on the protein1. Conventional stopped-flow mixers have allowed measurement of folding kinetics starting at about 1 ms. We have recently developed a microfluidic mixer that dilutes denaturant ~100-fold in ~8 &mu;s2. Unlike a stopped-flow mixer, this mixer operates in the laminar flow regime in which turbulence does not occur. The absence of turbulence allows precise numeric simulation of all flows within the mixer with excellent agreement to experiment3-4.
Laminar flow is achieved for Reynolds numbers Re &le;100. For aqueous solutions, this requires micron scale geometries. We use a hard substrate, such as silicon or fused silica, to make channels 5-10 &mu;m wide and 10 &mu;m deep (See Figure 1). The smallest dimensions, at the entrance to the mixing region, are on the order of 1 &mu;m in size. The chip is sealed with a thin glass or fused silica coverslip for optical access. Typical total linear flow rates are ~1 m/s, yielding Re~10, but the protein consumption is only ~0.5 nL/s or 1.8 &mu;L/hr. Protein concentration depends on the detection method: For tryptophan fluorescence the typical concentration is 100 &mu;M (for 1 Trp/protein) and for FRET the typical concentration is ~100 nM.
The folding process is initiated by rapid dilution of denaturant from 6 M to 0.06 M guanidine hydrochloride. The protein in high denaturant flows down a central channel and is met on either side at the mixing region by buffer without denaturant moving ~100 times faster (see Figure 2). This geometry causes rapid constriction of the protein flow into a narrow jet ~100 nm wide. Diffusion of the light denaturant molecules is very rapid, while diffusion of the heavy protein molecules is much slower, diffusing less than 1 &mu;m in 1 ms. The difference in diffusion constant of the denaturant and the protein results in rapid dilution of the denaturant from the protein stream, reducing the effective concentration of the denaturant around the protein. The protein jet flows at a constant rate down the observation channel and fluorescence of the protein during folding can be observed using a scanning confocal microscope5.

In this work we explain the fabrication and use of a microfluidic mixer capable of mixing two solutions in ~8 &mu;s. We also demonstrate the use of these mixers with spectroscopic detection using UV fluorescence and fluorescence resonance energy transfer (FRET).

Mezcladores de microfluidos para el estudio plegamiento de proteínas

The process by which a protein folds into its native conformation is highly relevant to biology and human health yet still poorly understood. One reason ...

Bioingeniería

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves numerous incubation and liquid transfer steps in order to achieve denaturation, reduction, alkylation, and cleavage. Adapting this workflow onto an automated workstation can increase efficiency and reduce coefficients of variance, thereby providing more reliable data for statistical comparisons between sample types. We previously described an automated proteomic sample preparation workflow1. Here, we report the development of a more efficient and better controlled workflow with the following advantages: 1) The number of liquid transfer steps is reduced from nine to six by combining reagents; 2) Pipetting time is reduced by selective tip pipetting using a 96-position pipetting head with multiple channels; 3) Potential throughput is increased by the availability of up to 45 deck positions; 4) Complete enclosure of the system provides improved temperature and environmental control and reduces the potential for contamination of samples or reagents; and 5) The addition of stable isotope labeled peptides, as well as &#946;-galactosidase protein, to each sample makes monitoring and quality control possible throughout the entire process. These hardware and process improvements provide good reproducibility and improve intra-assay and inter-assay precision (CV of less than 20%) for LC-MS based protein and peptide quantification. The entire workflow for digesting 96 samples in a 96-well plate can be completed in approximately 5 hours.

Here, we present an automated plasma protein digestion method for mass spectrometry-based quantitative proteomic analysis. In this protocol, the liquid transferring and incubation steps for protein denaturation, reduction, alkylation, and trypsin digestion reactions are streamlined and automated. It takes approximately five hours to prepare a 96-well plate with desired precision.

Una preparación de muestra de plasma para espectrometría de masas utilizando una estación de trabajo automatizada

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Platform Incubator with Movable XY Stage: A New Platform for Implementing In-Cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Fast Photochemical Oxidation of proteins (FPOP) coupled with mass spectrometry (MS) has become an invaluable tool in structural proteomics to interrogate protein interactions, structure, and protein conformational dynamics as a function of solvent accessibility. In recent years, the scope of FPOP, a hydroxyl radical protein foot printing (HRPF) technique, has been expanded to protein labeling in live cell cultures, providing the means to study protein interactions in the convoluted cellular environment. In-cell protein modifications can provide insight into ligand induced structural changes or conformational changes accompanying protein complex formation, all within the cellular context. Protein footprinting has been accomplished employing a customary flow-based system and a 248 nm KrF excimer laser to yield hydroxyl radicals via photolysis of hydrogen peroxide, requiring 20 minutes of analysis for one cell sample.To facilitate time-resolved FPOP experiments, the use of a new 6-well plate-based IC-FPOP platform was pioneered. In the current system, a single laser pulse irradiates one entire well, which truncates the FPOP experimental time frame resulting in 20 seconds of analysis time, a 60-fold decrease. This greatly reduced analysis time makes it possible to research cellular mechanisms such as biochemical signaling cascades, protein folding, and differential experiments (i.e., drug-free vs. drug bound) in a time-dependent manner. This new instrumentation, entitled Platform Incubator with Movable XY Stage (PIXY), allows the user to perform cell culture and IC-FPOP directly on the optical bench using a platform incubator with temperature, CO2 and humidity control. The platform also includes a positioning stage, peristaltic pumps, and mirror optics for laser beam guidance. IC-FPOP conditions such as optics configuration, flow rates, transient transfections, and H2O2 concentration in PIXY have been optimized and peer-reviewed. Automation of all components of the system will reduce human manipulation and increase throughput.

A new static platform is used to characterize protein structure and interaction sites in the native cell environment utilizing a protein footprinting technique called in-cell fast photochemical oxidation of proteins (IC-FPOP).

Incubadora de plataformas con etapa XY móvil: una nueva plataforma para implementar la oxidación fotoquímica rápida en células de proteínas

Fast Photochemical Oxidation of proteins (FPOP) coupled with mass spectrometry (MS) has become an invaluable tool in structural proteomics to interrogate ...

Digital Microfluidics for Automated Proteomic Processing

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and prognosis of disease. While clinical proteomic methods vary widely, a common characteristic is the need for (i) extraction of proteins from extremely heterogeneous fluids (i.e. serum, whole blood, etc.) and (ii) extensive biochemical processing prior to analysis. Here, we report a new digital microfluidics (DMF) based method integrating several processing steps used in clinical proteomics. This includes protein extraction, resolubilization, reduction, alkylation and enzymatic digestion. Digital microfluidics is a microscale fluid-handling technique in which nanoliter-microliter sized droplets are manipulated on an open surface. Droplets are positioned on top of an array of electrodes that are coated by a dielectric layer - when an electrical potential is applied to the droplet, charges accumulate on either side of the dielectric. The charges serve as electrostatic handles that can be used to control droplet position, and by biasing a sequence of electrodes in series, droplets can be made to dispense, move, merge, mix, and split on the surface. Therefore, DMF is a natural fit for carrying rapid, sequential, multistep, miniaturized automated biochemical assays. This represents a significant advance over conventional methods (relying on manual pipetting or robots), and has the potential to be a useful new tool in clinical proteomics.
Mais J. Jebrail, Vivienne N. Luk, and Steve C. C. Shih contributed equally to this work.
Sergio L. S. Freire's current address is at the University of the Sciences in Philadelphia located at 600 South 43rd Street, Philadelphia, PA 19104.

Digital Microfluidics is a technique characterized by the manipulation of discrete droplets (~nL - mL) on an array of electrodes by the application of electrical fields. It is well-suited for carrying out rapid, sequential, miniaturized automated biochemical assays. Here, we report a platform capable of automating several proteomic processing steps.

Microfluídica digitales para el procesamiento automatizado de Proteómica

Clinical proteomics has emerged as an important new discipline, promising the discovery of biomarkers that will be useful for early diagnosis and ...

Biología

Analyzing Large Protein Complexes by Structural Mass Spectrometry

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an array of dynamic, multi-protein complexes1. To gain a mechanistic understanding of the various cellular processes, it is crucial to determine the structure of such protein complexes, and reveal how their structural organization dictates their function. Many aspects of multi-protein complexes are, however, difficult to characterize, due to their heterogeneous nature, asymmetric structure, and dynamics. Therefore, new approaches are required for the study of the tertiary levels of protein organization.
One of the emerging structural biology tools for analyzing macromolecular complexes is mass spectrometry (MS)2-5. This method yields information on the complex protein composition, subunit stoichiometry, and structural topology. The power of MS derives from its high sensitivity and, as a consequence, low sample requirement, which enables examination of protein complexes expressed at endogenous levels. Another advantage is the speed of analysis, which allows monitoring of reactions in real time. Moreover, the technique can simultaneously measure the characteristics of separate populations co-existing in a mixture. 
Here, we describe a detailed protocol for the application of structural MS to the analysis of large protein assemblies. The procedure begins with the preparation of gold-coated capillaries for nanoflow electrospray ionization (nESI). It then continues with sample preparation, emphasizing the buffer conditions which should be compatible with nESI on the one hand, and enable to maintain complexes intact on the other. We then explain, step-by-step, how to optimize the experimental conditions for high mass measurements and acquire MS and tandem MS spectra. Finally, we chart the data processing and analyses that follow. Rather than attempting to characterize every aspect of protein assemblies, this protocol introduces basic MS procedures, enabling the performance of MS and MS/MS experiments on non-covalent complexes. Overall, our goal is to provide researchers unacquainted with the field of structural MS, with knowledge of the principal experimental tools.

Mass spectrometry has proven to be a valuable tool for analyzing large protein complexes. This method enables insights into the composition, stoichiometry and overall architecture of multi-subunit assemblies. Here, we describe, step-by-step, how to perform a structural mass spectrometry analysis, and characterize macromolecular structures.

El análisis de grandes complejos de proteínas por espectrometría de masas estructurales

Living cells control and regulate their biological processes through the coordinated action of a large number of proteins that assemble themselves into an ...

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing (Frog) Embryo

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design efficient remedies for diseases. Technologies enabling accurate identification and quantification of diverse types and large numbers of proteins would provide still missing information on molecular mechanisms orchestrating tissue and organism development in space and time. Here, we present a mass spectrometry-based protocol that enables the measurement of thousands of proteins in identified cell lineages in Xenopus laevis (frog) embryos. The approach builds on reproducible cell-fate maps and established methods to identify, fluorescently label, track, and sample cells and their progeny (clones) from this model of vertebrate development. After collecting cellular contents using microsampling or isolating cells by dissection or fluorescence-activated cell sorting, proteins are extracted and processed for bottom-up proteomic analysis. Liquid chromatography and capillary electrophoresis are used to provide scalable separation for protein detection and quantification with high-resolution mass spectrometry (HRMS). Representative examples are provided for the proteomic characterization of neural-tissue fated cells. Cell-lineage-guided HRMS proteomics is adaptable to different tissues and organisms. It is sufficiently sensitive, specific, and quantitative to peer into the spatio-temporal dynamics of the proteome during vertebrate development.

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo

Here we describe a mass spectrometry-based proteomic characterization of cell lineages with known tissue fates in the vertebrate Xenopus laevis embryo.

Proteómica de espectrometría de masas guiada por linaje celular en el embrión en desarrollo (rana)

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design ...

A Streamlined Approach for Mass Spectrometry-Based Proteomics Using Selected Tissue Regions

Mass spectrometry (MS)-based proteomics enables comprehensive proteome analysis across a wide range of biological samples, including cells, tissues, and body fluids. Formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue sections, commonly used for long-term archiving, have emerged as valuable resources for proteomic studies. Beyond their storage benefits, researchers can isolate regions of interest (ROIs) from normal tissue regions through collaborative efforts with pathologists. Despite this potential, a streamlined approach for proteomic experiments encompassing ROI isolation, proteomic sample preparation, and MS analysis remains lacking. In this protocol, an integrated workflow that combines macrodissection of ROIs, suspension trapping-based sample preparation, and high-throughput MS analysis is presented. Through this approach, the ROIs of patients' FFPE tissues, consisting of benign serous cystic neoplasms (SCN) and precancerous intraductal papillary mucinous neoplasms (IPMN) diagnosed by pathologists, were macrodissected, collected, and analyzed, resulting in high proteome coverage. Furthermore, molecular differences between the two distinct pancreatic cystic neoplasms were successfully identified, thus demonstrating the applicability of this approach for advancing proteomic research with FFPE tissues.

Here, we establish a mass spectrometry-based proteomic method using isolated regions of interest in formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections. This protocol is used to analyze proteome from specific tissue areas in archived formalin-fixed, paraffin-embedded tissue sections.

Mass spectrometry (MS)-based proteomics enables comprehensive proteome analysis across a wide range of biological samples, including cells, tissues, and ...