Este protocolo describe la preparación de muestras de ARN y la configuración de RMN para las mediciones de dispersión de relajación de protones R1rho para examinar el intercambio confirmacional en moléculas de ARN. Dado que los protones sondeados, el método no necesita etiquetado isotópico y puede acceder directamente a características estructurales como el emparejamiento de bases desplazado. La pipeta es bastante modular en el sentido de que la dispersión de relajación R1rho se puede medir incluso si la muestra se produce con un método diferente.
Comience preparando la muestra de plásmido y configurando una transcripción in vitro y una reacción de escisión como se describe en el manuscrito de texto. Incubar la reacción a 37 grados centígrados durante una hora. Luego diluya un microlitro de la muestra diez veces en solución de carga.
Y ejecute un microlitro en un gel PAGE desnaturalizador. Si la reacción de escisión es exitosa, escale la reacción al volumen deseado y eótela durante la noche. A continuación, ejecute otro gel PAGE desnaturalizar y evalúe si se ha completado la reacción de escisión.
En caso de escisión incompleta, caliente la solución de reacción en un microondas convencional a 450 vatios durante 15 segundos. Luego enfríe la solución lentamente a 37 grados Celsius durante 40 minutos para volver a annear el ARN y la guía de escisión. Y nótese la formación de un nuevo precipitado.
Agregue más pirofosfatasa inorgánica y RNasa H.Incubar la reacción durante una a tres horas a 37 grados centígrados. A continuación, confirme la finalización de la reacción de escisión con la desnaturalización de PAGE. Cuando se complete la reacción de escisión de la RNasa H, saciar la reacción agregando EDTA a una concentración final de 50 milimolares.
Y vórtice a fondo. Filtre la solución a través de un filtro de jeringa de 0,2 micras. Y concentre la solución en un volumen inyectable en un sistema HPLC para su purificación.
Antes de agregar la muestra concentrada y purificada al tubo de RMN, limpie el tubo enjuagando con abundante agua. Luego reactivo de descontaminación RNasa, agua y etanol al 95%. Después del enjuague final con agua, déjelo secar.
Enjuague el émbolo con agua y use una toallita sin pelusa para limpiar con reactivo de descontaminación RNasa y etanol al 95%. Después de secar el tubo y el émbolo, agregue 10% D2O a la muestra de RMN. Use una punta de pipeta grande para transferir la muestra de ARN al tubo de RMN, que fluye a lo largo del lado de la pared del tubo.
Inserte el émbolo en el tubo empujándolo hacia abajo con un movimiento de torsión rápido para eliminar las burbujas de aire, luego tire del émbolo hacia arriba lentamente sin crear nuevas burbujas de aire. Y arreglarlo con película de cera de parafina. Cree un nuevo conjunto de datos basado en un conjunto de datos HSQC de carbono de protones aromáticos utilizado en muestras de ARN completamente etiquetadas para la asignación de ARN.
Establezca los parámetros generales y los parámetros específicos de RD. A continuación, establezca la potencia de bloqueo de espín de protones a 1,2 kilohercios para las pruebas. Genere una lista vd de prueba con solo una entrada, cero milisegundos, establezca TDF1 en uno y actualice D30 para ejecutar un espectro de prueba.
Después de configurar una lista vd de prueba, actualice D30 y TDF1. Y traza la intensidad del pico para diferentes longitudes de bloqueo de giro. Identifique la longitud de bloqueo de giro a la que la intensidad del pico original disminuye a un tercio.
A partir del resultado de las ejecuciones de prueba, cree la lista vd final que se utilizará en el experimento. Seleccione el número de escaneos para que el pico más débil de la lista tenga una relación señal/ruido de al menos 10. Los resultados de varias reacciones de escisión de transcripciones en tándem se muestran aquí.
Se generó un ARN diana de 20 nucleótidos en una reacción exitosa. Las reacciones fallidas resultaron en una escisión incompleta y fallida de la muestra. La inyección de HPLC de la muestra de ARN reveló un pico de ARN objetivo puro a los 38 minutos.
Mientras que los productos más largos y más cortos estaban bien separados del pico de interés. El análisis de la horquilla de ARN mostró que el número de protones imino observados coincidía con el número de protones imino esperados de una simulación de estructura secundaria. El espectro HSQC de carbono de protones de las resonancias aromáticas del ARN mostró cuatro señales después del plegamiento.
Y solo tres señales antes de plegarse. En el representante sobre curvas de resonancia obtenidas para dos átomos de H8 diferentes y dos horquillas de ARN sintético diferentes, el G6H8 experimenta intercambio confirmacional. Mientras que el A4H8 no.
Para G6H8, se seleccionaron las potencias de bloqueo de giro de color y se registraron los datos de resonancia fuera. En la construcción CG donde el intercambio es lento, los valores de la fila R1rho versus la gráfica offset ya mostraban una ligera asimetría de la curva, lo que indica el signo de la diferencia de desplazamiento químico delta omega. Esto se hace aún más evidente en la gráfica R2 más REX donde se elimina la contribución R1.
Por otro lado, el constructo GC experimenta un intercambio más rápido y la gráfica de valores R1rho versus offset presentó una curva más amplia donde la extracción de delta omega se vuelve menos obvia incluso en la gráfica R2 más REX. Una vez que se ha dilucidado la dinámica del ARN, los estados pueden ser caracterizados y atrapados. Estos estados atrapados pueden, por ejemplo, ser probados en ensayos biológicos.
Este método nos permite observar cambios funcionales y relevantes de emparejamiento de bases en un complejo activo de microARN miRNA, reordenamientos de asa en ARN ribosómico y estabilidad de pares de bases de protuberancias de un solo nucleótido.
