Este protocolo identifica cuatro áreas clave para ayudar a mejorar la metodología y tener un trasplante de pulmón confiable. La primera es una técnica de manguito reproducible. El segundo es identificar de manera precisa y reproducible el cuarto espacio intercostal, un cierre completo de la herida y luego cómo recuperar y obtener muestras para su análisis.
Estas técnicas ayudan a desarrollar un método confiable de trasplante de pulmón para trabajar los mecanismos moleculares y desarrollar intervenciones terapéuticas. Comience con la configuración del dispositivo quirúrgico encendiendo el equipo de monitoreo de frecuencia cardíaca / saturación de oxígeno y calentando la placa a 42 grados centígrados. Además, encienda la máquina de ventilación y anestesia para precalentar el evaporador de isoflurano.
Llene una jeringa de anestesia con 10 mililitros de isoflurano líquido y monte la jeringa en la máquina de ventilación y anestesia. A continuación, encienda el microscopio quirúrgico con la altura y el enfoque ajustados a las preferencias y encienda el dispositivo de electrocauterio. Del mismo modo, prepare y coloque las herramientas quirúrgicas.
Determine el tamaño de calibre correcto del angiocatéter que se utilizará para hacer los manguitos en función del peso corporal de la rata consultando la tabla uno. Después de preparar los manguitos para la arteria pulmonar, el bronquio y la vena pulmonar, coloque el angiocatéter del tamaño apropiado sobre una superficie estéril bajo el microscopio quirúrgico. Luego, use una cuchilla quirúrgica número 11 en la parte posterior de la costilla para cortar el angiocatéter en un ángulo de 90 grados para formar un cuerpo de manguito de dos milímetros de largo con un ancho y altura de un milímetro en la parte superior del cuerpo del manguito.
Después de preparar la envoltura para la cirugía, haga una incisión cutánea de tres a cuatro centímetros de largo, en la mitad del cuello, con las tijeras, y diseccione cuidadosamente los tejidos y músculos subcutáneos con fórceps. Para la intubación endotraqueal, enhebra una sutura de seda 4-0 alrededor de la tráquea. Luego, inserte un angiocatéter de calibre 16 en la tráquea y ate la sutura alrededor de la tráquea firmemente con un nudo doble, seguido de un solo nudo para mantener el angiocatéter en su lugar.
Conecte el angiocatéter al ventilador para mantener un plano quirúrgico de anestesia en la rata con 1 a 2% de isoflurano. Use las tijeras para realizar una laparoesternotomía, como una incisión combinada de línea media y transversal. Luego, inyecte 1, 000 unidades por kilogramo de heparina con una jeringa de insulina a través de la vena cava inferior, o IVC, y espere 10 minutos para la circulación sistémica.
Mientras los pulmones están ventilando, corte las aurículas derecha e izquierda con tijeras de resorte de micro disección y luego introduzca un angiocatéter de calibre 18 a través de la arteria pulmonar para enjuagar los pulmones por gravedad con 20 mililitros de solución de preservación en una jeringa que cuelga a 28 centímetros de agua, conectada al tubo y al angiocatéter. Desconecte el ventilador del tubo endotraqueal para conectarlo a una jeringa de cinco mililitros llena con un volumen adecuado de aire basado en el peso corporal. Después de una hora de isquemia tibia, extirpe el bloqueo corazón-pulmón con las tijeras de resorte y fórceps de micro disección y colóquelo en una gasa estéril humedecida con PBS helado en una placa de Petri estéril sobre hielo.
Recorte cuidadosamente el área hiliar del pulmón izquierdo con una tijera de resorte Vannas-Tubingen y obtenga la vena pulmonar izquierda, la arteria pulmonar y el bronquio. Use un hemostático de mosquitos para agarrar la lengüeta del manguito. Luego, tome el extremo distal de la vena pulmonar, la arteria pulmonar o el bronquio a través del cuerpo apropiado del manguito y evert el tejido adicional alrededor del manguito antes de asegurarlo con 8-0 sutura de nylon.
Una vez hecho esto, use tijeras de resorte Vannas-Tubingen para recortar el tejido adicional y el manguito alrededor del cuerpo del manguito. Para preparar a la rata receptora, dibuje una línea en el pecho de la rata desde la muesca supraesternal hasta el proceso xifoides. En el centro de esta línea, dibuje una línea a lo largo del lado izquierdo del tórax que mida la mitad de la medición desde la muesca supraesternal hasta el proceso xifoides.
Usando el cable de fibra óptica conectado a una luz LED del kit de intubación endotraqueal, visualice e intube al receptor con un angiocatéter de calibre 16. Una vez que se extraigan los pulmones, coloque una gasa estéril alrededor del pulmón izquierdo mientras la sostiene con una pinza de bulldog Dieffenbach y aplique una pinza Yasargil en el área hiliar del pulmón izquierdo lo más proximal posible. Cuando la rata esté preparada, proceda a la anastomosis de la vena pulmonar colocando una sutura de nylon 7-0 alrededor de la vena pulmonar del receptor.
Incise la vena pulmonar del receptor con las tijeras de resorte Vannas-Tubingen cortando transversalmente las venas segmentarias superior e inferior lo más distalmente posible, y elimine la sangre con 0,2 mililitros de una unidad internacional por mililitro de solución salina heparinizada con una jeringa de insulina. Coloque el pulmón del donante envuelto con una gasa helada, húmeda y estéril en la cavidad torácica, e inserte la vena pulmonar con manguito del donante en la vena pulmonar del receptor antes de asegurar la anastomosis con la sutura de nylon 7-0 preposicionada. Para la anastomosis bronquial o bronquial, coloque una sutura de nylon 7-0 alrededor del bronquio del receptor antes de incidir el bronquio del receptor cortando transversalmente las vías respiratorias segmentarias superior e inferior lo más distalmente posible.
Después de insertar el bronquio esposado del donante en el bronquio del receptor, asegure la anastomosis con la sutura de nylon 7-0 preposicionada. A continuación, realice la anastomosis de la arteria pulmonar como se describió anteriormente. Para permitir la reprofusión y ventilación del pulmón del donante trasplantado, retire la pinza Yasargil en el hilio, seguido de cerrar la incisión de toracotomía con una sutura de nylon 6-0.
Recoja el líquido BAL de los pulmones nativos o trasplantados según lo desee. La relación peso húmedo a seco de los lóbulos se calculó para medir el edema pulmonar. El lóbulo trasplantado mostró un aumento significativo en la relación peso húmedo a seco en comparación con el lóbulo nativo del donante o receptor, lo que indica que no hay edema pulmonar.
En nuestra opinión, los dos pasos críticos de este procedimiento son uno, usar con precisión puntos de referencia anatómicos para identificar el cuarto espacio intercostal, y luego dos, seleccionar y usar adecuadamente los puños para tener una técnica de manguito reproducible. Un modelo de trasplante de pulmón de rata que sea reproducible y consistente es una base para las investigaciones moleculares sobre la reprofusión de isquemia y el trasplante en general.
