Para observar la exquisita ultra estructura natural de las células, es necesario fijar las células mediante congelación rápida. La congelación en sándwich es uno de los mejores métodos para congelar células sin formar cristales de hielo. Este protocolo demuestra el uso del dispositivo de congelación en sándwich y también describe el procedimiento para hacer secciones ultra delgadas de especímenes sustituidos por congelación después de la congelación en sándwich.
Comience a preparar propano líquido llenando el recipiente de nitrógeno líquido del dispositivo de congelación sándwich o SFD con nitrógeno líquido. Llene el recipiente de propano líquido con propano líquido introduciendo gas propano usando una boquilla fina. Acelere la solidificación del propano mediante el uso de una barra de metal enfriada.
Para preparar los discos de cobre de tipo plano y tipo cesta, colóquelos en un portaobjetos de vidrio con el lado sin letra hacia arriba y trátelos con descarga de resplandor a 10 pascales, 400 voltios, un miliamperio durante 30 segundos para hacer que la superficie del disco sea hidrófila utilizando un aparato de observación de iones. Transfiera la suspensión celular a un tubo centrífugo de dos mililitros y centrífuga a 2, 900 veces G durante 10 segundos a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante y suspenda el pellet para obtener una suspensión gruesa.
Coloque una pequeña cantidad o aproximadamente 0,02 microlitros de la suspensión celular en un disco de cobre. Cúbralo con otro disco de cobre y levante los discos con pinzas. Haga un pozo en el centro del propano sólido con la barra delgada de metal.
Coloque las pinzas en un SFD y congélelas rápidamente presionando el botón de inyección del aparato. Remoje las pinzas usadas en agua a temperatura ambiente para calentarlas y congelar las siguientes muestras. Utilizar tejidos animales y humanos fijados en 2,5% de glutaraldehído, tampón de fosfato molar 0,1 de pH 7,4.
Córtelos en secciones de 0.1 a 0.2 milímetros de grosor con una cuchilla de afeitar debajo de un microscopio estéreo. Coloque una pequeña gota de la solución de glutaraldehído en el disco de cobre tipo cesta, luego use pinzas para colocar un trozo de tejido en el glutaraldehído en el disco de cobre y cúbralo con el disco de cobre plano. Congelar rápidamente los discos con los tejidos en la fusión de propano del SFD como se demostró anteriormente.
Transfiera los discos a nitrógeno líquido en un baño de trabajo. Usando un par de pinzas enfriadas en nitrógeno líquido, separe los discos entre sí para exponer la muestra. Coloque los discos con las células en un vial de vidrio que esté lleno de un mililitro de acetona que contenga tetróxido de osmio al 2% que se haya colocado en nitrógeno líquido y solidificado.
Transfiera los discos a un congelador y manténgalos a menos 80 grados centígrados durante dos a cuatro días para la sustitución por congelación de las células. Lleve gradualmente los especímenes a temperatura ambiente incubándolos durante dos horas a menos 20 grados centígrados, dos horas a cuatro grados centígrados y 15 minutos a temperatura ambiente. Transfiera los discos a dos tubos de plástico de mililitros que estén llenos con un mililitro de acetona.
Prepare resina epoxi mezclando los reactivos en un recipiente de plástico desechable con un agitador. Intercambie la acetona sucesivamente con 30% de resina en acetona, 60% de resina y 90% de resina a temperatura ambiente durante una hora cada una, luego intercambie la resina 90% con 100% de resina a 37 grados centígrados durante la noche. Finalmente, incruste las muestras en resina 100% en el molde de incrustación de silicio y polimétlice a 60 grados centígrados durante 24 horas.
Saque los bloques polimerizados de los moldes de incrustación de silicio y escriba el número de muestra en el bloque. Retire los discos de cobre del bloque con una cuchilla de afeitar y recorte las muestras incrustadas en la superficie del bloque utilizando una cuchilla de recorte ultrasónico y cuchillas de afeitar bajo un microscopio estereoscópico. A continuación, aplique cinta adhesiva en el mandril de bloque de muestra y el soporte de muestra del microtomo y corte la cinta en el límite.
Retire el bloque del ultra microtomo, colóquelo en un microscopio estéreo y recórtelo aún más a 0,2 milímetros por 0,3 milímetros con una cuchilla de afeitar. Aplique neopreno en las rejillas para hacerlas adhesivas. Vuelva a colocar el bloque en el ultra microtomo alineando las partes pegadas.
Cubra el ultra microtomo con una cubierta de plástico y corte secciones de 50 a 70 nanómetros de espesor. Recupere las secciones mediante un bucle. Montarlos en rejillas de cobre de malla 300 o 400 tratadas con neopreno y secarlas.
Coloque las rejillas con secciones en la ranura del medio tubo de silicona. Remoje las muestras en solución de acetato de uranilo durante tres minutos. Recoja la solución de uranilo usada y guárdela en una jeringa.
Lave las muestras en un medio tubo con un chorro de agua, luego remoje las muestras en citrato de plomo durante tres minutos. Para muestras de levadura y hongos, coloque las rejillas en un papel de filtro, recójalas con pinzas y cúbralas con una película de naftalina polimerizada por plasma en la superficie del agua. Inserte las rejillas en el soporte de muestra de un microscopio electrónico, luego inserte el soporte de muestra en el microscopio electrónico y observe a 100 kilovoltios.
Las secciones ultra delgadas de E. coli y S.cerevisiae cuando se observaron bajo el microscopio electrónico mostraron morfología natural e imágenes claras. Se observaron secciones ultrafinas de células cultivadas rápidamente congeladas usando SFD bajo el microscopio electrónico. Las imágenes de secciones ultrafinas de la piel humana eran muy claras y mostraban una morfología natural.
Las partículas centrales del virus de la hepatitis B se congelaron rápidamente con SFD y se observaron mediante criomicroscopía electrónica. Lo más importante que debe recordar es que debe aplicar una cantidad muy pequeña de células en los discos de cobre para evitar la formación de cristales de hielo al congelarse. Al fijar los tejidos animales con glutaraldehído de antemano, se logra una buena congelación a una profundidad de aproximadamente 200 micrómetros similar a la profundidad lograda por la congelación a alta presión.
Esta técnica allana el camino para que un investigador observe la exquisita ultraestructura natural de las células fácilmente a bajo costo.
