Name: assessing whole-body lipid-handling capacity in mice
Uploaded: 2020-11-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
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Este trabajo es apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH), subvención R00-DK114498, y el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA), subvención CRIS: 3092-51000-062 a Y. Z.

Los animales se alojan en condiciones estandarizadas siguiendo protocolos experimentales y de cuidado animal aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Baylor College of Medicine (BCM). Los animales son alimentados con una dieta estándar o especial, agua ad libitum, y mantenidos con un ciclo día/noche de 12 horas.
1. Medición de lípidos séricos en ayunas
<ol><li>Transfiera los ratones a una nueva jaula después de las 5 PM y rápido con acceso gratuito al agua, durante la noche (con alrededor de 16 horas de ayuno antes del experimento). El ayuno nocturno asegura el vaciado completo de los tractos gastrointestinales de los ratones. NOTA: Los ratones comen sus heces durante el ayuno, por lo que la abstinencia de alimentos no puede garantizar que estén adecuadamente ayunados.</li>
	<li>A la mañana siguiente, agarre el ratón por la cola y colóquelo en una superficie. Tire suavemente hacia atrás en la cola del ratón para colocar el ratón en el reteneddor. Coloque la sujeción nasal para volver a entrenar el movimiento del ratón mientras permite que el ratón respire. Apriete la perilla de la sujeción de la nariz. Controle los movimientos del pecho para asegurarse de que el animal esté respirando normalmente y minimizar el tiempo que un ratón pasa en los sujetadores.</li>
	<li>Haga una incisión superficial (nick) en la vena de la cola del ratón que se mueve libremente y extraiga 25 μL de sangre de la incisión en un capilar de vidrio (llenando aproximadamente 1/3 del capilar) sin restringir al ratón. Sople rápidamente la sangre en un tubo de microcentrífuga.</li>
	<li>Detenga el sangrado con polvos estípticos, vuelva a llenar el alimento en la jaula y asegúrese de que los ratones no muestren signos de estrés.</li>
	<li>Complete la extracción de sangre para todos los ratones.</li>
	<li>Deje que la sangre coagule dejándola sin perturbar a temperatura ambiente durante 1 hora. Girar las muestras de sangre coaguladas a 2.000 x g a 4 °C durante 10 minutos en una microcentrífuga de sobremesa refrigerada y transferir sobrenadante (suero) para su análisis. NOTA: El suero se puede almacenar a –20 °C durante varias semanas hasta el análisis. Para el almacenamiento a largo plazo, mantenga el suero a –70 ° C.</li>
	<li>Analice cada metabolito lipídico utilizando el protocolo proporcionado por el fabricante.</li>
</ol>2. Prueba de tolerancia intralipídica oral
<ol><li>Después de las 5 PM, pese a los ratones para el cálculo del volumen intralípido que se les administrará al día siguiente. Luego, transfiera los ratones a una nueva jaula y ayunarlos durante la noche (16 horas).</li>
	<li>A la mañana siguiente, marque las colas de los ratones alojados en una jaula para ayudar a identificarlos en los pasos de sangrado posteriores.</li>
	<li>Haga un corte en la vena de la cola y extraiga 15 μL de sangre de la incisión en un capilar de vidrio (llenando aproximadamente 1/5 del capilar), y sople rápidamente la sangre en un tubo de microcentrífuga para T = 0 suero. NOTA: No hay necesidad de detener el sangrado durante el ensayo a menos que los ratones muestren sangrado excesivo.</li>
	<li>Ratones de gavage 20% intralipídicos usando una aguja de gavage 18G en una proporción de 15 μl por gramo de peso corporal, utilizando el peso corporal previo al ayuno. Apila cada ratón en 1 minuto. NOTA: Pese al animal y determine el tamaño apropiado de la aguja de sonda. En general, una aguja de sonda de calibre 18 es apropiada para ratones >25 g, y una aguja de sonda de calibre 20-22 sería más apropiada para animales más pequeños. Desaliña el ratón, agarrando la piel sobre los hombros para mantener la cabeza del animal en su lugar. Coloque la aguja de sonda en la boca y luego avance suavemente a lo largo del paladar superior, hasta que se alcance el esófago. El tubo debe pasar sin resistencia. Una vez que se alcanza la profundidad adecuada, el Intralipid se puede administrar lentamente. Retire suavemente la aguja siguiendo el mismo ángulo durante la inserción de la aguja después de administrar el Intralipid. Devuelva al animal a la jaula y controle si hay signos de dificultad para respirar u otra angustia. NOTA: Los investigadores que no tienen experiencia con técnicas de sonda oral o sangrado de la cola pueden apilar cada ratón por 2 minutos o incluso más.</li>
	<li>Extraer sangre a T = 1, 2, 3, 4, 5 y 6 horas: Extraer 15 μL de sangre (1/5 capilar) por ratón a través del sangrado de la cola, y soplar rápidamente la sangre en un tubo de microcentrífuga.</li>
	<li>Gire las muestras de sangre a 2.000 x g a temperatura ambiente durante 10 minutos en una microcentrífuga. Transfiera el sobrenadante, incluida la capa de grasa flotante, a un tubo de PCR para su almacenamiento. El sobrenadante puede almacenarse a –20 °C durante varias semanas hasta el análisis. NOTA: El sobrenadante debe ser plasma. Si algunas muestras ya se han coagulado en el momento de la centrifugación, no afecta la medición de triglicéridos.</li>
	<li>Después de la última recolección de sangre, detenga el sangrado con polvos estípticos, vuelva a llenar el alimento en la jaula y asegúrese de que los ratones no muestren signos de estrés extremo.</li>
	<li>Cargue 2 μL de triglicéridos estándar y recoja los sobrenadantes en una placa de 96 pozos.</li>
	<li>Agregue 200 μL de reactivo de triglicéridos y deje que la placa se incube durante 5 minutos a 37 ° C para el desarrollo del color.</li>
	<li>Mida la absorbancia a 500 nm con una longitud de onda de referencia de 660 nm en un lector de placas de laboratorio y calcule la concentración de la muestra.</li>
</ol>3. β3 Agonista del receptor adrenérgico CL 316,243 Ensayo de lipólisis estimulada
<ol><li>Preparar CL 316,243 como una solución de caldo de 5 mg/ml (50x) en solución salina estéril, y almacenar a –20°C hasta su uso.</li>
	<li>Por la mañana, pesa a los ratones para calcular la cantidad de solución diluida de CL 316,243 necesaria para el experimento. El ratón recibirá 10 μL por gramo de peso corporal de CL diluido 316.243, para una dosis final de 1 mg/kg de peso corporal.</li>
	<li>Transfiera los ratones a una nueva jaula con acceso gratuito al agua y ayuna durante 4 horas.</li>
	<li>Haga suficiente solución 1x CL 316,243 de 50x stock usando solución salina. La concentración final de 1 solución CL 316.243 es de 0,1 mg/ml. Use solución salina para el grupo de tratamiento de control.</li>
	<li>Marque las colas de los ratones alojados en la misma jaula para una fácil identificación durante los pasos de sangrado.</li>
	<li>Haga un corte en la vena de la cola y extraiga 15 μL de sangre de la incisión en un capilar de vidrio (llenando aproximadamente 1/5 del capilar), y sople rápidamente la sangre en un tubo de microcentrífuga para T = 0 muestra. NOTA: No hay necesidad de detener el sangrado durante el ensayo a menos que los ratones muestren sangrado excesivo.</li>
	<li>Inyecte la solución diluida de CL 316,243 (o control si se incluye en el experimento) por vía intraperitoneal a un volumen de 10 μL/g de peso corporal. Apila cada ratón en 1 minuto. Use un máximo de 5 ratones para cada experimento de 60 minutos, o 10 ratones para un equipo de dos personas.</li>
	<li>Extraer sangre en T = 5, 15, 30, 60 minutos: extraer 15 μL de sangre (1/5 capilar) por ratón a través del sangrado de la cola.</li>
	<li>Después de la última recolección de sangre, detenga el sangrado con polvos estípticos, vuelva a llenar el alimento en la jaula y asegúrese de que los ratones no muestren signos de estrés extremo.</li>
	<li>Girar muestras de sangre a 2.000 x g a 4 °C durante 5 minutos en una microcentrífuga refrigerada. Transfiera el sobrenadante a un tubo de PCR para su almacenamiento. El sobrenadante se puede almacenar a –20 °C durante varias semanas hasta el análisis.</li>
	<li>Cargue 1 μL de 2x estándares de glicerol diluido en serie (concentraciones equivalentes a trioleína de 0,156, 0,312, 0,625, 1,25 y 2,5 mg/ml) y recoja los sobrenadantes en una placa de 96 pozos. Agregue 100 μL de reactivo de glicerol libre y deje que la placa se incube durante 5 minutos a 37 ° C para que el color se desarrolle.</li>
	<li>Mida la absorbancia a 540 nm utilizando un lector de placas de laboratorio y calcule la concentración de la muestra.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dixon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+chylomicron+uptake+into+lacteals.">Mechanisms of chylomicron uptake into lacteals.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1207, 52-57 (2010).</li><li>Nuno, J., de Oya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoprotein+lipase:+review.">Lipoprotein lipase: review.</a> Revista Cl&#237;nica Espa&#241;ola. 170 (3-4), 83-87 (1983).</li><li>Williams, K. 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Presentation of a new animal model and mechanistic studies in human Apo A-I transgenic and control mice.</a> Journal of Clinical Investigation. 91 (4), 1665-1671 (1993).</li><li>Hogarth, C. A., Roy, A., Ebert, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genomic+evidence+for+the+absence+of+a+functional+cholesteryl+ester+transfer+protein+gene+in+mice+and+rats.">Genomic evidence for the absence of a functional cholesteryl ester transfer protein gene in mice and rats.</a> Comparative Biochemistry and Physiology - Part B: Biochemistry &amp; Molecular Biology. 135 (2), 219-229 (2003).</li><li>Tall, A. 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K., Singh, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triglyceride+and+cardiovascular+risk:+A+critical+appraisal.">Triglyceride and cardiovascular risk: A critical appraisal.</a> Indian Journal of Endocrinology and Metabolism. 20 (4), 418-428 (2016).</li><li>Miller, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Triglycerides+and+cardiovascular+disease:+a+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association.">Triglycerides and cardiovascular disease: a scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation. 123 (20), 2292-2333 (2011).</li><li>Dron, J. S., Hegele, R. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+relation+between+non-esterified+fatty+acids+in+plasma+and+the+metabolism+of+glucose.">A relation between non-esterified fatty acids in plasma and the metabolism of glucose.</a> Journal of Clinical Investigation. 35 (2), 150-154 (1956).</li><li>Bartelt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brown+adipose+tissue+activity+controls+triglyceride+clearance.">Brown adipose tissue activity controls triglyceride clearance.</a> Nature Medicine. 17 (2), 200-205 (2011).</li><li>de Souza, C. J., Burkey, B. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+3-adrenoceptor+agonists+as+anti-diabetic+and+anti-obesity+drugs+in+humans.">Beta 3-adrenoceptor agonists as anti-diabetic and anti-obesity drugs in humans.</a> Current Pharmaceutical Design. 7 (14), 1433-1449 (2001).</li><li>Braun, K., Oeckl, J., Westermeier, J., Li, Y., Klingenspor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Non-adrenergic+control+of+lipolysis+and+thermogenesis+in+adipose+tissues.">Non-adrenergic control of lipolysis and thermogenesis in adipose tissues.</a> Journal of Experimental Biology. 221, (2018).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los tres ensayos descritos funcionan de manera robusta en el laboratorio, con algunas consideraciones críticas. Se requiere ayuno nocturno para determinar los niveles de lípidos séricos en ayunas y la prueba de tolerancia intralipídica oral. Para la prueba de tolerancia intralipídica oral, es fundamental hacer girar la sangre a temperatura ambiente para minimizar la formación de una capa de grasa, especialmente en los puntos de tiempo de 1 y 2 horas; es importante no descartar esta capa de grasa si se forma. Asegúrese de transferir el sobrenadante con la capa lipídica y pipetee suavemente para mezclarlos para la determinación de triglicéridos.
Interpretación de los niveles de lípidos séricos en ayunas Se ha demostrado que el ayuno reduce los niveles de colesterol total en ratones7,mientras que el consumo crónico de dietas con alto contenido de grasa aumenta los niveles de colesterol total8. Hay dos tipos principales de colesterol: colesterol de lipoproteínas de alta densidad (HDL-C) y colesterol de lipoproteínas de baja densidad (LDL-C). El HDL-C es considerado como el lípido "bueno" en los seres humanos. Transporta el colesterol y lo transporta al hígado para ser eliminado del sistema. Los LDL-C constituyen la mayor parte del colesterol en el suero humano, y pueden acumularse en las arterias, lo que lleva a las principales enfermedades arteriales. Sin embargo, los ratones carecen de una enzima importante, la proteína de transferencia de éster colesterilo (CETP)9,que media el intercambio de triglicéridos por colesterol esterificado entre HDL y apoB-lipoproteínas10. Esto da a los ratones un perfil de partículas de lipoproteínas completamente diferente, siendo el HDL la especie principal. Como resultado, un cambio en los niveles de colesterol sérico total refleja principalmente cambios en los niveles de HDL-C.
Tanto en ratones como en humanos, los niveles séricos altos de triglicéridos pueden aumentar la inflamación de bajo grado y pueden afectar la función cardíaca11,12. Sin embargo, la HFD no aumenta los niveles séricos de triglicéridos. Los factores genéticos pueden desempeñar un papel dominante en los niveles séricos de triglicéridos sobre las condiciones metabólicas13. NEFA en la sangre puede ser ávidamente absorbido y utilizado por muchos órganos, suprimido por la insulina y la alimentación, y aumentado por la epinefrina14. La alimentación con HFD no cambia el nivel sérico de NEFA, lo que sugiere que la señal hormonal domina la regulación de los niveles séricos de NEFA.
Interpretación de la prueba oral de aclaramiento intralipídido Un intralípido administrado por vía oral es absorbido por las células epiteliales intestinales y transportado en partículas de lipoproteínas en el torrente sanguíneo, donde es liberado y utilizado por los órganos periféricos. Los cambios en la actividad de la lipoproteína lipasa, la absorción de triglicéridos en el tejido periférico y la oxidación afectarán la dinámica de los niveles séricos de triglicéridos. Por ejemplo, los adipocitos marrones y beige oxidan ávidamente los ácidos grasos para la producción de calor. La exposición al frío aumenta significativamente la actividad de los adipocitos marrones y beige, acelerando el aclaramiento plasmático de triglicéridos15. La prueba oral de depuración de tolerancia intralipídica fue crucial para evaluar los efectos de la exposición al frío sobre el metabolismo de los triglicéridos, como se demuestra en el artículo15.
Evaluación de compuestos dirigidos a la lipólisis del tejido adiposo La activación de la lipólisis es transmitida por el sistema nervioso simpático, los factores endocrinos y varios metabolitos. Muchos compuestos han sido puestos en desarrollo por las compañías farmacéuticas para promover la lipólisis del tejido adiposo16,17. La evaluación de su eficacia en modelos animales preclínicos como ratones es fundamental para facilitar el proceso de desarrollo. Aquí usamos un agonista del receptor β3-adrenérgico, CL 316,243, como ejemplo para ilustrar cómo podemos evaluar cómo responde un ratón al compuesto y si el ratón muestra diferentes niveles de sensibilidad al compuesto en diferentes estados metabólicos. Como se ve en los resultados ejemplares, el uso repetido de CL 316,243 causó desensibilización al tratamiento en los ratones. Se utilizó CL 316.243 para ilustrar cómo podríamos evaluar la respuesta de un ratón al tratamiento agudo; más importante aún, este concepto y diseño se puede aplicar fácilmente a otras moléculas dirigidas al metabolismo lipídico del tejido adiposo.
Limitaciones Algunas especies de lípidos seleccionadas ofrecen información limitada sobre el metabolismo de los lípidos en ratones. Debido a la pequeña cantidad de suero disponible por el sangrado de la cola, este protocolo mide solo el colesterol total y no distingue HDL-C y LDL-C, ya que esos ensayos requieren cantidades significativas de sangre. Debido a que los ratones son únicos en la forma en que carecen del CETP, el colesterol total es una buena aproximación, y más HDL-C en ratones no indica un perfil lipídico saludable, por lo que la información adicional obtenida al distinguir el colesterol en diferentes partículas de lipoproteínas es limitada.
Los niveles séricos de lípidos, incluidos los niveles de triglicéridos, suelen ser un efecto neto de absorción y excursión por muchos órganos que actúan de forma muy dinámica. La interpretación de los resultados generalmente requiere una configuración experimental con una sola variable. Como se muestra en el resultado ejemplar, no se puede llegar a una conclusión específica con respecto a la absorción o excursión de lípidos entre las subformas C57BL / 6J y C57BL / 6N de ratones C57BL / 6. Sin embargo, en el citado estudio de exposición al frío15,el conocimiento previo y, a veces, las suposiciones se pueden utilizar para excluir las contribuciones de otras variables, y los autores pudieron precisar a un tejido específico y descubrieron que el tejido adiposo marrón contribuyó al aclaramiento mejorado de triglicéridos.
Por último, el metabolismo es un proceso dinámico. El cambio de un metabolito en una vía metabólica lipídica proporciona solo una instantánea del estado general. Para comprender el flujo, se requiere un estudio de flujo más sofisticado utilizando técnicas de rastreo de isótopos.
En resumen, la simplicidad es tanto el poder como la debilidad de este protocolo. Los tres ensayos presentados aquí no están diseñados para el estudio de vías específicas del metabolismo de los lípidos, sino más bien para proporcionar un cribado inicial o un punto de partida para evaluar el metabolismo de los lípidos en la nutrición general y la investigación de la obesidad.

Los carbohidratos y los lípidos son dos sustratos principales para el metabolismo energético. El metabolismo aberrante de los lípidos resulta en muchas enfermedades humanas, incluida la diabetes tipo II, las enfermedades cardiovasculares, las enfermedades del hígado graso y los cánceres. Los lípidos dietéticos, principalmente los triglicéridos, se absorben a través del intestino hacia el sistema linfático y entran en la circulación venosa en los quilomicrones cerca del corazón1. Los lípidos son transportados por partículas de lipoproteínas en el torrente sanguíneo, donde las partes de ácidos grasos son liberadas por la acción de la lipoproteína lipasa en órganos periféricos como el músculo y el tejido adiposo2. Las partículas remanentes restantes ricas en colesterol son eliminadas por el hígado3. Los ratones han sido ampliamente utilizados en laboratorios como modelo de investigación para estudiar el metabolismo de los lípidos. Con conjuntos de herramientas genéticas completas disponibles y un ciclo de reproducción relativamente corto, son un modelo poderoso para estudiar cómo se absorben, sintetizan y metabolizan los lípidos.
Debido a la complejidad del metabolismo de los lípidos, los sofisticados estudios de lipidómica o los estudios de trazadores isotópicos se utilizan generalmente para cuantificar colecciones de especies lipídicas o flujos y destinos metabólicos relacionados con los lípidos4,5. Esto crea un desafío masivo para los investigadores sin equipo especializado o experiencia. En este artículo, presentamos tres ensayos que pueden servir como pruebas iniciales antes de que se utilicen técnicas técnicamente desafiantes. Son procedimientos no terminales para los ratones y, por lo tanto, muy útiles para identificar diferencias potenciales en la capacidad de manejo de lípidos y reducir los procesos afectados.
En primer lugar, medir las moléculas de lípidos séricos en ayunas puede ayudar a determinar el perfil lipídico general de un ratón. Los ratones deben ayunar, porque muchas especies de lípidos aumentan después de las comidas, y el alcance del aumento se ve fuertemente afectado por la composición de la dieta. Muchas moléculas de lípidos, incluyendo el colesterol total, los triglicéridos y los ácidos grasos no esterificados (NEFA), se pueden medir utilizando un kit comercial y un lector de placas que puede leer la absorbancia.
En segundo lugar, una prueba de tolerancia intralipídica oral evalúa la capacidad de manejo de lípidos como un efecto neto de la absorción y el metabolismo. Un intralípido administrado por vía oral causa un aumento en los niveles circulantes de triglicéridos (1-2 horas), después de lo cual los niveles séricos de triglicéridos vuelven a los niveles basales (4-6 horas). Este ensayo ofrece información sobre qué tan bien un ratón puede manejar los lípidos exógenos. El corazón, el hígado y el tejido adiposo marrón son consumidores activos de triglicéridos, mientras que el tejido adiposo blanco lo almacena como una reserva de energía. Los cambios en estas funciones darán lugar a diferencias en los resultados de las pruebas.
Por último, promover la lipólisis para movilizar los lípidos almacenados se considera una posible estrategia para la pérdida de peso. La vía de señalización del receptor β3-adrenérgico en el tejido adiposo juega un papel importante en la lipólisis de adipocitos, y la genética humana ha identificado un polimorfismo de pérdida de función Trp64Arg en el receptor β3-adrenérgico correlacionado con la obesidad6. CL 316,243, un agonista específico y potente del receptor β3-adrenérgico, estimula la lipólisis del tejido adiposo y la liberación de glicerol. La evaluación de la respuesta de un ratón a CL 316,243 puede proporcionar información valiosa sobre el desarrollo, la mejora y la comprensión de la eficacia del compuesto.
Colectivamente, estas pruebas se pueden utilizar como una prueba inicial para detectar cambios en el estado metabólico lipídico de los ratones. Se eligen por la accesibilidad de los instrumentos y reactivos. Con los resultados derivados de estos ensayos, los investigadores pueden formar una imagen general de la aptitud metabólica de sus animales y decidir sobre enfoques más sofisticados y específicos.

<table><tbody><tr><td>20% Intralipid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I141</td><td></td></tr><tr><td>BD Slip Tip Sterile Syringes 1ml</td><td>Shaotong</td><td>B07F1KRMYN</td><td></td></tr><tr><td>CL 316,243 Hydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5976</td><td></td></tr><tr><td>Curved Feeding Needles (18 Gauge)</td><td>Kent Scientific</td><td>FNC-18-2-2</td><td></td></tr><tr><td>Free Glycerol Reagent</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F6428</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol Standard Solution</td><td>Sigma</td><td>G7793</td><td></td></tr><tr><td>HR SERIES NEFA-HR(2)COLOR REAGENT A</td><td>Fujifilm Wako Diagnostics</td><td>999-34691</td><td></td></tr><tr><td>HR SERIES NEFA-HR(2)COLOR REAGENT B</td><td>Fujifilm Wako Diagnostics</td><td>991-34891</td><td></td></tr><tr><td>HR SERIES NEFA-HR(2)SOLVENT A</td><td>Fujifilm Wako Diagnostics</td><td>995-34791</td><td></td></tr><tr><td>HR SERIES NEFA-HR(2)SOLVENT B</td><td>Fujifilm Wako Diagnostics</td><td>993-35191</td><td></td></tr><tr><td>Matrix Plus Chemistry Reference Kit</td><td>Verichem</td><td>9500</td><td></td></tr><tr><td>Micro Centrifuge Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-222-168</td><td></td></tr><tr><td>Microhematrocrit Capillary Tube, Not Heparanized</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-362-574</td><td></td></tr><tr><td>NEFA STANDARD SOLUTION</td><td>Fujifilm Wako Diagnostics</td><td>276-76491</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Boston Bioproducts</td><td>BM-220</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Triglycerides Reagent</td><td>Fisher Scientific</td><td>TR22421</td><td></td></tr><tr><td>Total Cholesterol Reagents</td><td>Thermo Scientifi</td><td>TR13421</td><td></td></tr></tbody></table>

assessing whole-body lipid-handling capacity in mice

La evaluación del metabolismo lipídico es una piedra angular de la evaluación de la función metabólica, y se considera esencial para los estudios de metabolismo in vivo. Los lípidos son una clase de muchas moléculas diferentes con muchas vías involucradas en su síntesis y metabolismo. Se necesita un punto de partida para evaluar la hemostasia lipídica para la investigación de la nutrición y la obesidad. Este artículo describe tres métodos fáciles y accesibles que requieren poca experiencia o práctica para dominar, y que pueden ser adaptados por la mayoría de los laboratorios para detectar anomalías en el metabolismo de los lípidos en ratones. Estos métodos son (1) medir varias moléculas de lípidos séricos en ayunas utilizando kits comerciales (2) evaluar la capacidad de manejo de lípidos en la dieta a través de una prueba de tolerancia intralipídica oral, y (3) evaluar la respuesta a un compuesto farmacéutico, CL 316,243, en ratones. Juntos, estos métodos proporcionarán una visión general de alto nivel de la capacidad de manejo de lípidos en ratones.

Mostramos con tres extractos que cada ensayo ofrece información valiosa sobre el metabolismo lipídico de los ratones. Para los ratones machos C57BL / 6J, desafiados por ocho semanas de alimentación con dieta alta en grasas (HFD) a partir de las ocho semanas de edad, los niveles de colesterol total se elevaron significativamente, mientras que los triglicéridos séricos y NEFA no lo fueron (Tabla 1), lo que sugiere que los triglicéridos y NEFA en la sangre no están regulados predominantemente por un desafío de grasa en la dieta. En la segunda cohorte de ratones, las subformas C57BL/6J y C57BL6/N de C57BL6 fueron alimentadas con HFD durante ocho semanas, a partir de las ocho semanas de edad. Sus niveles séricos de triglicéridos se compararon después de un desafío intralipídico oral. Los resultados demostraron una diferencia sorprendente entre las subformas 6N y 6J, con 6J teniendo un pico significativamente más alto en los niveles séricos de triglicéridos después de la administración intralipídica, lo que indica una absorción mejorada o un aclaramiento de triglicéridos mucho más lento(Figura 1). Por último, para los ratones machos C57BL / 6J de ocho semanas de edad alimentados con chow normal (NC), un solo tratamiento con CL 316,243 (1 mg / kg de peso corporal) condujo a un aumento significativo en el glicerol sérico. Sin embargo, el pretratamiento intraperitoneal diario de ratones con 1 mg/kg de peso corporal CL 316,243 durante una semana condujo a una reacción embotada a CL 316,243, lo que sugiere el desarrollo de resistencia a CL 3116,263 en esos ratones(Figura 2).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Parámetros séricos</td>
			<td>NC</td>
			<td>HFD</td>
			<td>Valor P</td>
		</tr>
<tr>
<td>Colesterol (mg/dL)</td>
			<td>132,7±10,3</td>
			<td>202.3±8.4</td>
			<td>0.0002</td>
		</tr>
<tr>
<td>Triglicéridos (mg/dL)</td>
			<td>91,7±9,1</td>
			<td>79,3±4,5</td>
			<td>0.26</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ácidos grasos no esterificados (mmol/L)</td>
			<td>1.47±0.12</td>
			<td>1.48±0.08</td>
			<td>0.73</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Especies de lípidos en ayunas en ratones alimentados con chow normal (NC) o dieta alta en grasas (HFD) durante ocho semanas. Los datos se expresan como valores medios ± SEM. N = 6 para el grupo NC, n = 12 para el grupo HFD. Elvalor de P se determinó utilizando la prueba tde Student de dos colas.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61927/61927fig1v3.jpg"> Figura 1: Un ejemplo de resultados que demuestran la diferencia en los triglicéridos séricos de las subformas C57BL/6 después de un desafío intralipídico oral. Los datos se expresan como valores medios ± SEM. N = 5 para cada grupo. Elvalor de P se determinó utilizando la prueba tde Student de dos colas en cada punto de tiempo. * p < .05, ** p < .01. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61927/61927fig1v3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61927/61927fig2v3.jpg"> Figura 2: Un ejemplo de resultados que demuestran el desarrollo de resistencia al tratamiento con CL 316,243 en ratones C57BL/6J después de una semana de tratamiento diario con CL 316,243. Los datos se expresan como valores medios ± SEM. N = 5 para cada grupo. Elvalor de P se determinó utilizando la prueba tde Student de dos colas en cada punto de tiempo. ** p < .01. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/61927/61927fig2v3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

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Assessing Whole-Body Lipid-Handling Capacity in Mice

Este documento proporciona tres ensayos fáciles y accesibles para evaluar el metabolismo de los lípidos en ratones.

Evaluación de la capacidad de manejo de lípidos de todo el cuerpo en ratones

Assessing lipid metabolism is a cornerstone of evaluating metabolic function, and it is considered essential for in vivo metabolism studies. Lipids are a ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

3.9K vistas.  Baylor College of Medicine. Este documento proporciona tres ensayos fáciles y accesibles para evaluar el metabolismo de los lípidos en ratones.

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Shotgun Lipidomics of Rodent Tissues

Lipids play a vital role as essential components of all prokaryotic and eukaryotic cells. Constant technological improvements in mass spectrometry have made lipidomics a powerful analytical tool for monitoring tissue lipidome compositions in homeostatic as well as disease states. This paper presents a step-by-step protocol for a shotgun lipid analysis method that supports the simultaneous detection and quantification of a few hundred molecular lipid species in different tissue and biofluid samples at high throughput. This method leverages automated nano-flow direct injection of a total lipid extract spiked with labeled internal standards without chromatographic separation into a high-resolution mass spectrometry instrument. Starting from sub-microgram amounts of rodent tissue, the MS analysis takes 10 min per sample and covers up to 400 lipids from 14 lipid classes in mouse lung tissue. The method presented here is well suited for studying disease mechanisms and identifying and quantifying biomarkers that indicate early toxicity or beneficial effects within rodent tissues.

Shotgun mass spectrometry-based lipidomics delivers a sensitive quantitative snapshot of a broad spectrum of lipid classes simultaneously in a single measurement from various rodent tissues.

Lipidómica de escopeta de tejidos de roedores

Lipids play a vital role as essential components of all prokaryotic and eukaryotic cells. Constant technological improvements in mass spectrometry have ...

Investigación

Bioquímica

Evaluación de la esteatosis hepática con reconstrucción de gotas lipídicas con fluorescencia 3D

Analysis of Fluorescent-Stained Lipid Droplets with 3D Reconstruction for Hepatic Steatosis Assessment

Lipid droplets (LDs) are specialized organelles that mediate lipid storage and play a very important role in suppressing lipotoxicity and preventing dysfunction caused by free fatty acids (FAs). The liver, given its critical role in the body's fat metabolism, is persistently threatened by the intracellular accumulation of LDs in the form of both microvesicular and macrovesicular hepatic steatosis. The histologic characterization of LDs is typically based on lipid-soluble diazo dyes, such as Oil Red O (ORO) staining, but a number of disadvantages consistently hamper the use of this analysis with liver specimens. More recently, lipophilic fluorophores 493/503 have become popular for visualizing and locating LDs due to their rapid uptake and accumulation into the neutral lipid droplet core. Even though most applications are well-described in cell cultures, there is less evidence demonstrating the reliable use of lipophilic fluorophore probes as an LD imaging tool in tissue samples. Herein, we propose an optimized boron dipyrromethene (BODIPY) 493/503-based protocol for the evaluation of LDs in liver specimens from an animal model of high-fat diet (HFD)-induced hepatic steatosis. This protocol covers liver sample preparation, tissue sectioning, BODIPY 493/503 staining, image acquisition, and data analysis. We demonstrate an increased number, intensity, area ratio, and diameter of hepatic LDs upon HFD feeding. Using orthogonal projections and 3D reconstructions, it was possible to observe the full content of neutral lipids in the LD core, which appeared as nearly spherical droplets. Moreover, with the fluorophore BODIPY 493/503, we were able to distinguish microvesicles (1 &#181;m &lt; d &#8804; 3 &#181;m), intermediate vesicles (3 &#181;m &lt; d &#8804; 9 &#181;m), and macrovesicles (d &gt; 9 &#181;m), allowing the successful discrimination of microvesicular and macrovesicular steatosis. Overall, this BODIPY 493/503 fluorescence-based protocol is a reliable and simple tool for hepatic LD characterization and may represent a complementary approach to the classical histological protocols.

Autor destacado: Análisis de gotas de lípidos teñidas con fluorescente con reconstrucción 3D para la evaluación de la esteatosis hepática  

Herein, we demonstrate an optimized BODIPY 493/503 fluorescence-based protocol for lipid droplet characterization in liver tissue. Through the use of orthogonal projections and 3D reconstructions, the fluorophore allows for successful discrimination between microvesicular and macrovesicular steatosis and may represent a complementary approach to the classical histological protocols for hepatic steatosis assessment.

Análisis de gotitas de lípidos teñidas con fluorescencia con reconstrucción 3D para la evaluación de la esteatosis hepática

Lipid droplets (LDs) are specialized organelles that mediate lipid storage and play a very important role in suppressing lipotoxicity and preventing ...

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic study in the liver. Here, numerous assays are described to comprehensively measure the phenotype and parameters of hepatic steatosis in mouse and hepatocyte models. 
Combining the physiological, histological, and biochemical methods, this system can be used to assess the progress of hepatic steatosis. In vivo, the measurements of body weight and nuclear magnetic resonance (NMR) provide a general understanding of mice in a non-invasive manner. Hematoxylin and Eosin (H&amp;E) and Oil Red O staining determine the histological morphology and lipid deposition of liver tissue under nutrient overload conditions, such as high-fat diet feeding. Next, the total lipid contents are isolated by chloroform/methanol extraction, which are followed by a biochemical analysis for triglyceride and cholesterol. Moreover, mouse primary hepatocytes are treated with high glucose plus insulin to stimulate lipid accumulation, an efficient in vitro model to mimic diet-induced hyperglycemia and hyperinsulinemia in vivo. Then, the lipid deposition is measured by Oil Red O staining and chloroform/methanol extraction. Oil Red O staining determines intuitive hepatic steatotic phenotypes, while the lipid extraction analysis determines the parameters that can be analyzed statistically. The present protocols are of interest to scientists in the fields of fatty liver diseases, insulin resistance, and type 2 diabetes.

Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis

Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described.

Análisis optimizada de<em&gt; En Vivo</em&gt; y<em&gt; In Vitro</em&gt; La esteatosis hepática

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic ...

Medicina

Body Composition and Metabolic Caging Analysis in High Fat Fed Mice

Alterations to body composition (fat or lean mass), metabolic parameters such as whole-body oxygen consumption, energy expenditure, and substrate utilization, and behaviors such as food intake and physical activity can provide important information regarding the underlying mechanisms of disease. Given the importance of body composition and metabolism to the development of obesity and its subsequent sequelae, it is necessary to make accurate measures of these parameters in the pre-clinical research setting. Advances in technology over the past few decades have made it possible to derive these measures in rodent models in a non-invasive and longitudinal fashion. Consequently, these metabolic measures have proven useful when assessing the response of genetic manipulations (for example knockout or transgenic mice, viral knock-down or overexpression of genes), experimental drug/compound screening and dietary, behavioral or physical activity interventions. Herein, we describe the protocols used to measure body composition and metabolic parameters using an animal monitoring system in chow-fed and high fat diet-fed mice.

This protocol describes the use of a body composition analyzer and metabolic animal monitoring system to characterize body composition and metabolic parameters in mice. An obesity model induced by high-fat feeding is used as an example for the application of these techniques.

Composición corporal y análisis jaulas metabólico en ratones de reserva grasa alta

Alterations to body composition (fat or lean mass), metabolic parameters such as whole-body oxygen consumption, energy expenditure, and substrate ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

Bioquímica y de Evaluación de Rendimiento microscópica de masa grasa en<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

Biología

Imaging and Analysis of Oil Red O-Stained Whole Aorta Lesions in an Aneurysm Hyperlipidemia Mouse Model

Apolipoprotein E (Apoe)- or low density lipoprotein receptor (Ldlr)-deficient hyperlipidemic mice are the two most commonly used models for atherosclerosis research. They are used to study the impact of a various genetic factors and different cell types on atherosclerotic lesion formation and as well as test the development of new therapies. Isolation, excision of the whole aorta, and quantification of Oil Red O-stained atherosclerotic lesions are basic morphometric methods used to evaluate atherosclerotic burden. The goal of this protocol is to describe an optimized, step-by-step surgical method to dissect, perfuse-fix, isolate, stain, image and analyze atherosclerotic lesions in mouse aortas with Oil Red O. Because atherosclerotic lesions can form anywhere in the entire aortic tree, this whole aorta Oil Red O staining method has the advantage of evaluating lipid-laden plaques in the entire aorta and all branches in a single mouse. In addition to Oil Red O staining, fresh isolated whole aortas can be used for variety of in vitro and in vivo experiments and cell isolations.

This protocol provides a step-by-step procedure to analyze atherosclerotic burden in mice. Investigators can use this protocol to compare the abundance, location, and size of atherosclerotic lesions in different animals.

Imágenes y análisis de lesiones de aorta entera teñidas de O de color rojo aceite en un modelo de ratón con hiperlipidemia por aneurisma

Apolipoprotein E (Apoe)- or low density lipoprotein receptor (Ldlr)-deficient hyperlipidemic mice are the two most commonly used models for ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid oxidation, or alternatively, synthesize new lipid via de novo lipogenesis. The net sum of these pathways is dictated by a number of factors, which in certain disease states leads to fatty liver disease. Excess hepatic lipid accumulation is associated with whole body insulin resistance and coronary heart disease. Tools to study lipid metabolism in hepatocytes are useful to understand the role of hepatic lipid metabolism in certain metabolic disorders.
In the liver, hepatocytes regulate the breakdown and synthesis of fatty acids via &#946;-fatty oxidation and de novo lipogenesis, respectively. Quantifying metabolism in these pathways provides insight into hepatic lipid handling. Unlike in vitro quantification, using primary hepatocytes, making measurements in vivo is technically challenging and resource intensive. Hence, quantifying &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis in cultured mouse hepatocytes provides a straight forward method to assess hepatocyte lipid handling. 
Here we describe a method for the isolation of primary mouse hepatocytes, and we demonstrate quantification of &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis, using radiolabeled substrates.

De novo lipogenesis and &#946;-fatty acid oxidation constitute key metabolic pathways in hepatocyte, pathways that are perturbed in several metabolic disorders, including fatty liver disease. Here we demonstrate isolation of mouse primary hepatocytes and describe quantification of &#946;-fatty acid oxidation and lipogenesis.

Determinación de la oxidación de ácidos grasos y la lipogénesis en el ratón hepatocitos primarios

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Investigación de la fisiopatología de la HFpEF en un modelo de ratón inducido por hiperlipidemia

A Murine Model of Hyperlipidemia&#45;Induced Heart Failure with Preserved Ejection Fraction

The pathophysiology of heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF) driven by lipotoxicity is incompletely understood. Given the urgent need for animal models that accurately mimic cardio-metabolic HFpEF, a hyperlipidemia-induced murine model was developed by reverse engineering phenotypes seen in HFpEF patients. This model aimed to investigate HFpEF, focusing on the interplay between lipotoxicity and metabolic syndrome. Hyperlipidemia was induced in wild-type (WT) mice on a 129J strain background through bi-weekly intraperitoneal injections of poloxamer-407 (P-407), a block co-polymer that blocks lipoprotein lipase, combined with a single intravenous injection of adeno-associated virus 9-cardiac troponin T-low-density lipoprotein receptor (AAV9-cTnT-LDLR). Extensive assessments were conducted between 4 and 8 weeks post-treatment, including echocardiography, blood pressure recording, whole-body plethysmography, echocardiography (ECG) telemetry, activity wheel monitoring (AWM), and biochemical and histological analyses. The LDLR/P-407 mice exhibited distinctive features at four weeks, including diastolic dysfunction, preserved ejection fraction, and increased left ventricular wall thickness. Notably, blood pressure and renal function remained within normal ranges. Additionally, ECG and AWM revealed heart blocks and reduced activity, respectively. Diastolic function deteriorated at eight weeks, accompanied by a significant decline in respiratory rates. Further investigation into the double treatment model revealed elevated fibrosis, wet/dry lung ratios, and heart weight/body weight ratios. The LDLR/P-407 mice exhibited xanthelasmas, ascites, and cardiac ischemia. Interestingly, sudden deaths occurred between 6 and 12 weeks post-treatment. The murine HFpEF model offers a valuable and promising experimental resource for elucidating the intricacies of metabolic syndrome contributing to diastolic dysfunction within the context of lipotoxicity-mediated HFpEF.

Autor destacado: Explorando la relación entre la lipotoxicidad y la HFpEF 

This protocol presents a detailed approach to replicating a murine model of hyperlipidemia-induced heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF). The design combines the administration of adeno-associated virus 9-cardiac troponin T-low-density lipoprotein receptor (AAV9-cTnT-LDLR) and poloxamer-407 (P-407).

Un modelo murino de insuficiencia cardíaca inducida por hiperlipidemia con fracción de eyección preservada

The pathophysiology of heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF) driven by lipotoxicity is incompletely understood. Given the urgent need for ...

Evaluación de la capacidad de manejo de lípidos de todo el cuerpo en ratones

Resumen

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Lipidómica de escopeta de tejidos de roedores

Análisis de gotitas de lípidos teñidas con fluorescencia con reconstrucción 3D para la evaluación de la esteatosis hepática

Análisis de gotitas de lípidos teñidas con fluorescencia con reconstrucción 3D para la evaluación de la esteatosis hepática

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Análisis optimizada de

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