Este trabajo fue posible gracias al apoyo a la infraestructura operativa del Gobierno del Estado de Victoria y al NHMRC IRIISS del Gobierno australiano y contó con el apoyo de la financiación del Consejo Nacional de Salud e Investigación Médica (ALW #1120300) y el Consejo Australiano de Investigación (KJH #FT190100265). A los autores les gustaría agradecer el apoyo técnico de la Monash Animal Research Platform, la Monash Histology Platform y el Monash Micro Imaging facility.

Los ovarios se recogieron de ratones hembra C57BL6J. Todos los procedimientos y experimentos con animales se realizaron de conformidad con el Código australiano de prácticas para el cuidado y uso de animales de la NHMRC y fueron aprobados por el Comité de Ética Animal de la Plataforma de Investigación Animal de Monash.
NOTA: Un agente quimioterapéutico demostrado para agotar los ovocitos del folículo primordial, según lo determinado usando la estereología11 y las cuentas directas12,13 fue utilizado en este informe para comparar los dos métodos de cuenta en el mismo animal. Hembra, 8-week-old (adulto joven) ratones fueron pesados antes de una sola inyección intraperitoneal de 75 mg/kg/bodyweight del ciclofosfamida, o control salino del vehículo (n=5/group). Se ha demostrado que esta dosis causa un agotamiento aproximado del 50% de los folículos primordiales, pero no se ha informado que cause morbilidad o mortalidad en ratones14. Los ovarios fueron cosechados 48 horas después del tratamiento. Un ovario de cada animal se fijó en una solución de formalina tamponada neutra al 10% (v/v) durante 24 horas, y el otro se fijó en la solución de Bouin durante 24 horas. A continuación, el tejido se incrustó en resina de glicolmetacrilato y se seccionó en serie a 20 μm, o en parafina y se seccionó en serie a 5 μm. Todos los tejidos fueron manchados con Schiff y hematoxylin ácidos periódicos.
1. Preparación histológica: fijación, procesamiento, incrustación y seccionamiento de ovarios de ratón
<ol><li>Diseccione los ovarios de ratón recortando el oviducto y toda la grasa circundante, sin dañar o cortar el ovario en sí. Si es necesario, utilice un microscopio de disección y una cuchilla fina para este paso (Figura 1A).</li>
	<li>Fije los tejidos inmediatamente colocándolos en un pequeño tubo etiquetado que contenga el fijador de Bouin (estereología) o el fijador de formalina (recuentos directos) durante 24 horas(Figura 1B),antes de transferir los tejidos al etanol al 70%. NOTA: La morfología del folículo se conserva mejor dentro del tejido ovárico fijo de Bouin, incrustado en la resina de glicolmetacrilato(Figura 2).</li>
	<li>Procese ovarios fijos enteros y luego incruste en resina de glicolmetacrilato para estereología(Archivo Suplementario 1),o cera de parafina para recuentos directos utilizando un protocolo histológico estándar. PRECAUCIÓN: La resina es tóxica, así que asegúrese de que todos los pasos de procesamiento de tejido se realizan en una campana extractora de humos y guantes se usan en todo momento.</li>
	<li>Utilice un microtomo especializado en metacrilato de resina(Figura 1C)equipado con un cuchillo de vidrio(Figura 1D)para cortar exhaustivamente secciones gruesas de resina de glicolmetacrilato (por ejemplo, 20 μm). Recoja las secciones a intervalos regulares (por ejemplo, cada3ª sección) en portaobjetos de microscopio de vidrio para estereología.</li>
	<li>Utilice un microtomo estándar para cortar secciones delgadas de parafina (por ejemplo, 4-6 μm). Recoja las secciones del tejido en un intervalo regular (e.g., cada9ta sección) en una diapositiva del microscopio de cristal para las cuentas directas del folículo.</li>
	<li>Manche los portaobjetos con ácido periódico Schiff y hematoxilina (Expediente Suplementario 2).</li>
	<li>Cubrebocas con DPX estándar para secciones de parafina, o DPX grueso para secciones de resina de glicolmetacrilato (Figura 1E). PRECAUCIÓN: La resina de glicolmetacrilato DPX es peligrosa, así que realice este paso en la campana extractora de humos. NOTA: La resina de glicolmetacrilato DPX es extremadamente viscosa. La cubierta de vidrio debe adherirse firmemente presionando hacia abajo con una espátula para garantizar que la DPX esté dispersa de manera uniforme y fina, y que no haya burbujas de aire presentes debajo de la cubierta(Figura 1F).</li>
</ol>2. Estimación estereológica del número de folículos primordiales utilizando el fraccionador óptico
<ol><li>Encienda la computadora, la unidad de control múltiple, la cámara y la fuente de luz dentro de la configuración de estereología y establezca el objetivo del microscopio en un aumento bajo (por ejemplo, 10x).</li>
	<li>Abra el software de estereología.</li>
	<li>Coloque el primer portaobjetos de forma segura en la etapa del microscopio.</li>
	<li>Ajuste la exposición a la luz marcando Automático en Exposición en el panel Ajustes de la cámara ( Figurasuplementaria 1A). Alternativamente, ajuste manualmente la exposición a la luz.</li>
	<li>Utilice el joystick para localizar la primera muestra de tejido y enfocar la muestra.</li>
	<li>Ajuste el balance de blancos, ya sea haciendo clic en Más ajustes (ubicado en la parte inferior derecha del panel Configuración de la cámara), y luego haga clic en Balance de blancos y haga clic en Automático ( Figurasuplementaria 1B). Como alternativa, haga clic en el botón Balance de blancos junto al botón Más configuraciones (o Seleccione área en Más configuraciones), para establecer el balance de blancos manualmente seleccionando un área blanca en la sección.</li>
	<li>Vaya al menú desplegable Sondas y haga clic en Flujo de trabajo del fraccionador óptico. A continuación, haga clic en Iniciar nuevo proyecto y haga clic en Aceptar.
	<ol>
<li>Si se ha guardado una configuración de muestreo existente, en Parámetros de muestreo, haga clic en Sí | ... y seleccione la configuración de muestreo deseada.</li>
		<li>Si no es así, haga clic en No e introduzca manualmente la información de la sección serie(Figura suplementaria 1C)y defina la configuración de la sonda en el paso 2.13.</li>
	</ol></li>
	<li>Haga clic en Siguiente, ajuste el microscopio a Bajo aumento y elija aumento de 10x en el menú desplegable.</li>
	<li>Haga clic en Siguiente, y luego trace alrededor de toda la sección ovárica – comience haciendo clic izquierdo alrededor de la sección y al final, haga clic derecho y elija Cerrar contorno.</li>
	<li>Haga clic en Siguiente, ajuste el microscopio a Alta ampliación y elija 100x Aumento de aceite en el menú desplegable.</li>
	<li>Coloque una gota de aceite en la sección de tejido en el portaobjetos y mueva el objetivo del microscopio a un aumento de 100x.</li>
	<li>Ajuste la exposición a la luz (como en el paso 2.4) y haga clic en Siguiente.</li>
	<li>Configure los Parámetros de muestreo para definir la configuración del sondeo. Aquí, el marco de conteo se estableció en 47,5 μm x 47,5 μm (2.256,25 μm2)y la longitud del paso se estableció en 100 μm x 100 μm (10.000 μm2)(Figura suplementaria 2). Una vez establecidos los parámetros de muestreo, guarde la plantilla y vuelva a abrirla durante las sesiones de análisis posteriores en el paso 2.7.</li>
	<li>Haga clic en Empezar a contar ( Figura suplementaria1D). Concéntrese en la parte superior de la muestra, haga clic en Aceptar y comience a contar.</li>
	<li>Utilice la perilla de enfoque para moverse a través de la profundidad de muestreo de 10 μm y contar los folículos primordiales cuyo núcleo de ovocitos entra en foco. Haga clic en Siguiente para desplazarse a la siguiente área.<ol>
<li>Clasificar los folículos como primordiales si el ovocito está rodeado de células escamosas (aplanadas) de la granulosa, pero no de células granulosas cuboidales(Figura 2A). NOTA: Los folículos primordiales son distintos de los folículos intermedios/transitorios, que comprenden una combinación de células granulosas cuboidales y escamosas(Figura 2B),y folículos primarios, que están rodeados predominantemente por células granulosas cuboidales(Figura 2C). Estas clases foliculares deben cuantificarse por separado.</li>
		<li>Sólo cuentan los folículos en los que el núcleo del ovocito es visible. El núcleo del ovocito debe aparecer dentro del marco de conteo o estar tocando las líneas de inclusión verde del marco de conteo (Figura Suplementaria 1E,F).</li>
		<li>Si el núcleo del ovocito cae fuera del marco de conteo(Figura Suplementaria 1G)o toca las líneas de exclusión rojas del marco de conteo, no cuente este folículo.</li>
		<li>Al evaluar el agotamiento del folículo primordial en respuesta a una sustancia química exógena (por ejemplo, quimioterapia), asegúrese de que todos los folículos contados estén sanos y, por lo tanto, tengan una morfología normal(Figura 2). Cuente los folículos anormales o atretic por separado. A menudo, la muerte del folículo es inducida por insultos como la quimioterapia, y la cuantificación de los folículos atreticos debe obtenerse por separado para distinguir entre folículos sanos y atreticos, ya que sólo los folículos sanos comprenden la reserva ovárica15.</li>
	</ol></li>
	<li>Una vez completado el recuento en esa sección, realice una de las siguientes acciones:<ol>
<li>Haga clic en Agregar nueva seccióny, a continuación, vuelva al paso 2.3 para configurar la siguiente sección para el recuento.</li>
		<li>Haga clic en He terminado de contar para finalizar la sesión. Devuelva el objetivo a 10x, salga del software de estereología y apague la fuente de luz, la cámara, la unidad de control múltiple y la computadora.</li>
	</ol></li>
	<li>Obtenga la suma del número de folículo bruto (Q) de cada sección de tejido muestreada de todo el ovario, luego, utilizando una hoja de cálculo, utilice la ecuación a continuación para obtener el valor final de cada animal replicado (N)4. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ01.jpg">Dónde: N = Número total estimado de folículos dentro del ovario. Q = Recuento de folículos primordiales crudos. f1 = Intervalo de muestreo. Cada3ª sección fue muestreada <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ02.jpg"> así. f2 = Relación entre el marco de recuento (área de muestra) y el paso a paso, calculada como <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ03.jpg"> . Dado que el área de la muestra era de 2256μm 2 (47,5 μm x 47,5 μm) y el área paso a paso era de 10000 μm2 (100 μm x 100 μm), <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ04.jpg"> . f3 = Fracción de la sección ovárica muestreada. Dado que se muestreó 10 μm de la sección de 20 μm, <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ05.jpg"> . Por lo tanto, <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ06.jpg"> . NOTA: Este protocolo describe cómo aplicar estos principios de los análisis estereológicos utilizando un software de estereología ampliamente citado(Tabla de materiales); sin embargo, hay otro software estereológico disponible. Los principios aplicados durante los análisis estereológicos de los folículos ováricos son los mismos, independientemente del software utilizado para configurar los parámetros. La estereología es más precisa cuando se cuentan 100 o más objetos en un ovario de ratón adulto4,ya que esto da un coeficiente de error para la estimación por debajo del 10%16. Los parámetros de muestreo descritos aquí se han optimizado para garantizar que un mínimo de aproximadamente 100 objetos (es decir, folículos primordiales, transitorios y primarios) se puedan contar en los ovarios adultos de tipo salvaje C57BL6J de control. Se puede realizar un estudio piloto que incluya un tamaño de muestra pequeño para establecer los parámetros de muestreo óptimos, como el intervalo y el número de secciones a analizar y el número de disectores ópticos dentro de las secciones muestreadas17.</li>
</ol>3. Estimación del número de folículos primordiales por recuentos directos de folículos ováricos
<ol><li>Coloque el portaobjetos del microscopio de forma segura bajo un microscopio de luz estándar y realice recuentos directos para obtener el número de folículos primordiales en bruto.<ol>
<li>Clasificar los folículos como primordiales si el ovocito es claramente visible y está rodeado de células escamosas (aplanadas) de la granulosa, pero no de células granulosas cuboidales(Figura 2D). NOTA: Los folículos primordiales son distintos de los folículos intermedios/transitorios, que comprenden una combinación de células granulosas cuboidales y escamosas(Figura 2E),y folículos primarios, que están rodeados predominantemente por células granulosas cuboidales(Figura 2F). Estas clases foliculares deben cuantificarse por separado.</li>
		<li>Asegúrese de que todos los folículos contados estén sanos y por lo tanto tengan una morfología normal (Figura 2). Cuente cualquier folículo anormal o atretic por separado, pues solamente los folículos sanos comprenden la reserva ovárica.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Alternativamente, tome múltiples o cosidas fotomicrografías de alta potencia (por ejemplo, 20x) de toda la sección de tejido ovárico para realizar recuentos abriendo los archivos de imagen. Esto se puede hacer manualmente, o utilizando un escáner de diapositivas automatizado.</li>
	<li>Obtenga la suma del número de folículo bruto (Q) de cada sección de tejido muestreada de todo el ovario en el intervalo predeterminado. Multiplique este número por el inverso de la fracción de muestreo para obtener el valor final para cada animal replicado (N), utilizando la siguiente ecuación. <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ07.jpg">Dónde: N = Número total estimado de folículos dentro del ovario. Q = Recuento de folículos sin procesar (de cada tipo individual, calculado por separado). f1 = Intervalo de muestreo. Cada9ª sección fue muestreada <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ08.jpg"> así. Por lo tanto, <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/61782/61782equ09.jpg"> .</li>
</ol>

<ol>
	<li>Stringer, J. M., Winship, A., Liew, S. H., Hutt, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+capacity+of+oocytes+for+DNA+repair.">The capacity of oocytes for DNA repair.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (15), 2777-2792 (2018).</li><li>Winship, A. L., Stringer, J. M., Liew, S. H., Hutt, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+DNA+repair+for+maintaining+oocyte+quality+in+response+to+anti-cancer+treatments,+environmental+toxins+and+maternal+ageing.">The importance of DNA repair for maintaining oocyte quality in response to anti-cancer treatments, environmental toxins and maternal ageing.</a> Human Reproduction Update. 24 (2), 119-134 (2018).</li><li>Broer, S. L., Broekmans, F. J., Laven, J. S., Fauser, B. 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S., Capel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+iDISCO+and+CUBIC+tissue+clearing+and+lightsheet+microscopy+for+in+toto+analysis+of+the+adult+mouse+ovarydagger.">Combined iDISCO and CUBIC tissue clearing and lightsheet microscopy for in toto analysis of the adult mouse ovarydagger.</a> Biology of Reproduction. 102 (5), 1080-1089 (2020).</li><li>Kagami, K., Shinmyo, Y., Ono, M., Kawasaki, H., Fujiwara, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+evaluation+of+murine+ovarian+follicles+using+a+modified+CUBIC+tissue+clearing+method.">Three-dimensional evaluation of murine ovarian follicles using a modified CUBIC tissue clearing method.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 16 (1), 72 (2018).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este artículo proporciona un protocolo paso a paso para la técnica del patrón oro para enumerar los folículos primordiales del ratón, la estereología, y el método más comúnmente empleado de cuenta directa del folículo. El tratamiento de quimioterapia fue utilizado para comparar y para contrastar los resultados obtenidos de estos dos diversos métodos dentro del ovario izquierdo y derecho del mismo animal. Ambos métodos revelaron alta variabilidad inter-animal en números primordiales del folículo. Un agotamie...

Los ovocitos inmaduros, meiotically-arrestados almacenados dentro de los folículos primordiales en el ovario son la unidad de almacenamiento para la línea germinal femenina y comprenden la reserva ovárica de por vida de un individuo. Los números de folículos primordiales disminuyen naturalmente con la edadde 1,o alternativamente, pueden agotarse prematuramente después de la exposición a productos químicos exógenos, incluidos algunos productos farmacéuticos y tóxicos ambientales en el aire, los alimentos y el agua2. Dado que el número de folículos primordiales es finito, la cantidad y calidad de los folículos presentes en el ovario determinan en gran medida la fertilidad femenina y la salud de la descendencia. Así, la cuantificación exacta del número primordial del folículo en mujeres es esencial para evaluar los impactos fuera de la blanco de insultos exógenos en la reserva ovárica.
En las mujeres, el análisis de todo el ovario generalmente no es posible, por lo que las medidas sustitutas no invasivas de la reserva ovárica deben utilizarse en un entorno clínico. La hormona anti-mϋlleriana (AMH) es el biomarcador sustituto más utilizado clínicamente3. Los niveles séricos de AMH a menudo se miden en mujeres de edad materna avanzada, o antes y después del tratamiento del cáncer, como la quimioterapia. Sin embargo, la AMH es producida por folículos en crecimiento y no por folículos primordiales, y por lo tanto, los niveles séricos no informan sobre el número absoluto de folículos primordiales.
Con la ausencia de métodos para determinar con precisión el número de folículos primordiales en mujeres in situ,el recuento de folículos ováricos en modelos animales pequeños, como los roedores, sigue siendo una herramienta de investigación esencial para evaluar el grado en que los insultos exógenos impactan en los folículos primordiales y, por lo tanto, en la fertilidad. Desafortunadamente, sin embargo, los informes a lo largo de la literatura de los números de folículos primordiales en modelos de roedores son altamentevariables 4. Una de las principales razones de esto son las diferencias técnicas ampliamente reportadas en el método de conteo empleado. Predominantemente, hay dos técnicas diferentes descritas en la literatura para enumerar folículos primordiales en ratones. Estos incluyen la estereología, que emplea el método de disector óptico del fraccionador, y los recuentos directos de folículos.
La estereología es ampliamente considerada el patrón oro, ya que utiliza el muestreo aleatorio uniforme sistemático5,por lo que es el método más preciso de cuantificar el número de folículos primordiales en ratones enteros, o ovarios de rata4,6,7. La estereología es imparcial, ya que explica la estructura tridimensional del objeto de interés8. Utilizando un método de disector/fraccionador óptico, se aplican tres niveles de muestreo para cuantificar los folículos primordiales utilizando secciones gruesas de tejido (por ejemplo, 20 μm) dentro de una fracción conocida del ovario total del ratón. En primer lugar, se elige el intervalo de muestreo (por ejemplo, cada3ª sección) al azar (fracción de muestreo 1, f1)4. Las secciones se muestrea de una manera sistemática y uniforme desde este punto hasta todo el ovario. Luego, un marco de conteo imparcial se superpone sobre la sección ovárica y se mueve progresivamente a lo largo de una cuadrícula de conteo definida y aleatoria (fracción de muestreo 2, f2)8. Por último, se muestrea ópticamente una fracción conocida del espesor de la sección (por ejemplo, 10 μm) y se cuentan los folículos dentro de esta área (fracción de muestreo 3, f3)4. El número de folículos en bruto se multiplica por la inversa de estas fracciones de muestreo para obtener el valor final. Este método requiere capacitación y equipo de expertos, incluido un microscopio con una etapa motorizada impulsada por un software estereológico. Los tejidos deben preservarse en un fijador especializado de Bouin, e incrustarse en resina de glicolmetacrilato para permitir que las secciones gruesas de tejido se corten utilizando un microtome de resina de glicolmetacrilato con un cuchillo de vidrio. Este método está diseñado para explicar la contracción y deformación de los tejidos, para preservar mejor la estructura morfológica tridimensional del ovario y los folículos9.
El conteo directo de folículos es el método más utilizado para contar folículos10. Se pueden usar fijadores más comunes (es decir, formol), seguidos de incrustación de cera de parafina y seccionamiento en serie exhaustivo utilizando un microtomo estándar a un espesor de entre 4-6 μm. Los folículos se cuentan sistemáticamente en toda la sección del tejido en un intervalo definido, y luego se multiplican por la inversa del intervalo de muestreo para obtener la estimación del folículo total. Este método es rápido, fácil, se puede realizar usando tejidos archivados, y preparado usando técnicas histológicas estándar. Requiere solamente un microscopio ligero con capacidades estándar de la proyección de imagen. Sin embargo, a pesar de estas ventajas, el conteo directo de folículos carece de la precisión y los parámetros de conteo estrictos de la estereología, lo que lo hace más propenso al sesgo del investigador. Además, los tejidos pueden sufrir contracción y deformación durante el procesamiento, interrumpiendo la integridad y la morfología del ovario y, por lo tanto, dificultando la clasificación y cuantificación del folículo.
El objetivo de este artículo es describir dos métodos de uso común para evaluar cuantitativamente el número de folículos primordiales en los ovarios de ratón: estereología y recuento directo de folículos. Proporcionaremos protocolos detallados para estos dos métodos y destacaremos algunas de sus fortalezas y debilidades, con el fin de mejorar la reproducibilidad en nuestro campo y permitir a los investigadores tomar una decisión informada del método de conteo más apropiado para sus estudios.

<table><tbody><tr><td>1-Butanol (HPLC)</td><td>Fisher Chemical</td><td>#A383-1</td><td></td></tr><tr><td>Acid alcohol</td><td>Amber Scientific</td><td>#ACDL</td><td></td></tr><tr><td>Bouin&amp;rsquo;s fixative</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#HT10132</td><td>Picric acid 0.9% (w/v), formaldehyde 9% (v/v), acetic acid 5% (w/v)</td></tr><tr><td>Cyclophosphamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#C0768-5G</td><td></td></tr><tr><td>Dibutylphthalate Polystyrene Xylene (DPX)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#06522</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Amber Scientific</td><td>#ETH</td><td>Ethanol 100%</td></tr><tr><td>Micro Feather opthalmic scalpel with aluminium handle</td><td>Designs for Vision</td><td>#FEA-745-SR</td><td>Feather blade for dissections (seen in Figure 1)</td></tr><tr><td>Formalin fixative</td><td>Australian Biostain</td><td>#ANBFC</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslip</td><td>Thermo Scientific</td><td>#MENCS22501GP</td><td>22 mm x 50 mm</td></tr><tr><td>Glycomethacrylate resin RM2165 microtome</td><td>Leica Microsystems</td><td>#RM2165</td><td></td></tr><tr><td>Glycolmethacrylate DPX</td><td>*made in house</td><td></td><td>*Mix 1.5 L Xylene; 800 g polystyrene pellets; 100mL Dibutyl phthalate for 3 weeks</td></tr><tr><td>Histolene</td><td>Trajan</td><td>#11031</td><td></td></tr><tr><td>Mayer&amp;rsquo;s haematoxylin</td><td>Amber Scientific</td><td>#MH</td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX50 microscope</td><td>Olympus</td><td>#BX50</td><td>Brightfield microscope fitted with 10x dry &amp;amp; 100x oil immersion objective (numerical aperture 1.3)</td></tr><tr><td>Olympus immersion oil type-F</td><td>Olympus</td><td>#IMMOIL-F30CC</td><td></td></tr><tr><td>Olympus TH4-200 light source</td><td>Olympus</td><td>#TH4-200</td><td></td></tr><tr><td>Paraffin wax</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#03987</td><td></td></tr><tr><td>Periodic acid</td><td>Trajan</td><td>#PERI1%</td><td>Periodic acid 1%</td></tr><tr><td>Rotary Microtome CUT 4060</td><td>MicroTec</td><td>#4060R/F</td><td>Used to cut paraffin sections</td></tr><tr><td>Schiff&amp;rsquo;s reagent</td><td>Trajan</td><td>#SCHF</td><td></td></tr><tr><td>Scott&#039;s tap water</td><td>Amber Scientific</td><td>#SCOT</td><td>Potassium carbonate, magnesium sulphate, water</td></tr><tr><td>StereoInvestigator Stereological System</td><td>MBF Bioscience</td><td></td><td>Includes StereoInvestigator software, multi-control unit, automatic stage and joystick</td></tr><tr><td>Superfrost microscope slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>#MENSF41296SP</td><td>1 mm, 72 pcs</td></tr><tr><td>Technovit 7100 Plastic embedding system</td><td>Emgrid Australia</td><td>#64709003</td><td>500 mL/5 x 1 g/40 mL</td></tr><tr><td>Technovit 3040 yellow</td><td>Emgrid Australia</td><td>#64708805</td><td>100 g/80 mL</td></tr></tbody></table>

accurate follicle enumeration in adult mouse ovaries

Las hembras que se reproducen sexualmente nacen con su suministro de ovocitos durante toda su vida. Los ovocitos inmaduros y quietos se encuentran dentro de los folículos primordiales, la unidad de almacenamiento de la línea germinal femenina. No son renovables, por lo que su número al nacer y la posterior tasa de pérdida dictan en gran medida la esperanza de vida fértil de la mujer. La cuantificación precisa del número de folículos primordiales en mujeres y animales es esencial para determinar el impacto de los medicamentos y tóxicos en la reserva ovárica. También es necesario para evaluar la necesidad y el éxito de las técnicas de preservación de la fertilidad existentes y emergentes. Actualmente, no existen métodos para medir con precisión el número de folículos primordiales que comprenden la reserva ovárica en las mujeres. Además, la obtención de tejido ovárico de animales grandes o especies en peligro de extinción para la experimentación a menudo no es factible. Por lo tanto, los ratones se han convertido en un modelo esencial para tales estudios, y la capacidad de evaluar los números de folículos primordiales en ovarios enteros de ratón es una herramienta crítica. Sin embargo, los informes de los números absolutos del folículo en ovarios del ratón en la literatura son altamente variables, haciendo difícil comparar y/o replicar datos. Esto se debe a una serie de factores que incluyen la tensión, la edad, los grupos de tratamiento, así como las diferencias técnicas en los métodos de conteo empleados. En este artículo, proporcionamos una guía instructiva paso a paso para preparar secciones histológicas y contar folículos primordiales en ovarios de ratón utilizando dos métodos diferentes: [1] estereología, que se basa en la técnica de fraccionador / disector óptico; y [2] la técnica de conteo directo. Se destacarán algunas de las principales ventajas e inconvenientes de cada método para que se pueda mejorar la reproducibilidad en el campo y para que los investigadores puedan seleccionar el método más adecuado para sus estudios.

Un modelo bien-caracterizado del agotamiento del folículo fue utilizado, por el que los ratones femeninos adultos jovenes fueran administrados una dosis sola de la quimioterapia del ciclofosfamida, o del control salino del vehículo (n=5/group) y ambos ovarios fueron cosechados de cada animal después de 48 horas. Se preparó un ovario por animal como se describe en el Paso 1 para cada uno de los dos métodos: estereología o recuentos directos. El ovario izquierdo y derecho de cada animal fue asignado aleatoriamente a ...

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Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

Aquí, describimos, comparamos, y ponemos en contraste dos diversas técnicas para la cuenta exacta del folículo de tejidos ováricos fijos del ratón.

Enumeración exacta del folículo en ovarios adultos del ratón

Sexually reproducing female mammals are born with their entire lifetime supply of oocytes. Immature, quiescent oocytes are found within primordial ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.2K vistas.  Monash University. Aquí, describimos, comparamos, y ponemos en contraste dos diversas técnicas para la cuenta exacta del folículo de tejidos ováricos fijos del ratón.

Video: Accurate Follicle Enumeration in Adult Mouse Ovaries

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together within a basement membrane. A finite pool of follicles is laid down during embryonic development, when oocytes in meiotic arrest form a close association with flattened granulosa cells, forming primordial follicles. By or shortly after birth, mammalian ovaries contain their lifetime&#8217;s supply of primordial follicles, from which point onwards there is a steady release of follicles into the growing follicular pool.
The ovary is particularly amenable to development in vitro, with follicles growing in a highly physiological manner in culture. This work describes the culture of whole neonatal ovaries containing primordial follicles, and the culture of individual ovarian follicles, a method which can support the development of follicles from an immature through to the preovulatory stage, after which their oocytes are able to undergo fertilization in vitro. The work outlined here uses culture systems to determine how the ovary is affected by exposure to external compounds. We also describe a co-culture system, which allows investigation of the interactions that occur between growing follicles and the non-growing pool of primordial follicles.

This protocol describes the primary culture/co-culture of mouse ovarian tissue, using ovaries from neonatal mice and individual ovarian follicles from prepubertal mice. The culture techniques support development in a highly physiological manner, allowing investigation of the effect of extrinsic agents on the ovary, and of interactions between ovarian follicles.

Cultura y Co-cultura de ratón ovarios y los folículos ováricos

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Retrieval of Mouse Oocytes

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus Genetic Stock Center (http://stkctr.biol.sc.edu), we are characterizing the salient differences needed to develop this system.  A primary goal has been to optimize oocyte/early embryo retrieval.

This protocol illustrates the technique for extracting oocytes or early-stage fertilized embryos from the oviduct of mice. The ability to identify the infindibulum and insert a blunt end needle into it is essential to correctly performing the procedure.

Recuperación de los ovocitos de ratón

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus ...

Biología

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We quantitatively assessed follicle survival, measured follicle and oocyte diameters, and examined ultrastructure of the oocytes produced from the system. We observed decreased follicle survival, downregulation of expressions of proliferating cell nuclear antigen and growth differentiation factor 9, as indicators for the development of granulosa cells and oocytes, respectively, and oocyte ultrastructural abnormalities under the simulated microgravity condition. The simulated microgravity experimental setup needs to be optimized to provide a model for investigation of the mechanisms involved in the oocyte/follicle in vitro development.

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

A highly promising technique to generate tissue constructs without using matrix is to culture cells in a simulated microgravity condition. Using a rotary culture system, we examined ovarian follicle growth and oocyte maturation in terms of follicle survival, morphology, growth, and oocyte function under the simulated microgravity condition.

In Vitro Crecimiento de los folículos Preantral ratón bajo microgravedad simulada

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

A Neural Network-Based Identification of Developmentally Competent or Incompetent Mouse Fully-Grown Oocytes

Infertility clinics would benefit from the ability to select developmentally competent vs. incompetent oocytes using non-invasive procedures, thus improving the overall pregnancy outcome. We recently developed a classification method based on microscopic live observations of mouse oocytes during their in vitro maturation from the germinal vesicle (GV) to the metaphase II stage, followed by the analysis of the cytoplasmic movements occurring during this time-lapse period. Here, we present detailed protocols of this procedure. Oocytes are isolated from fully-grown antral follicles and cultured for 15 h inside a microscope equipped for time-lapse analysis at 37 &#176;C and 5% CO2. Pictures are taken at 8 min intervals. The images are analyzed using the Particle Image Velocimetry (PIV) method that calculates, for each oocyte, the profile of Cytoplasmic Movement Velocities (CMVs) occurring throughout the culture period. Finally, the CMVs of each single oocyte are fed through a mathematical classification tool (Feed-forward Artificial Neural Network, FANN), which predicts the probability of a gamete to be developmentally competent or incompetent with an accuracy of 91.03%. This protocol, set up for the mouse, could now be tested on oocytes of other species, including humans.

Here, we present a protocol for non-invasive assessment of oocyte developmental competence performed during their in vitro maturation from the germinal vesicle to the metaphase II stage. This method combines time-lapse imaging with particle image velocimetry (PIV) and neural network analyses.

Una identificación basada en redes neuronal desarrollo competentes o incompetentes adulto de ovocitos de ratón

Infertility clinics would benefit from the ability to select developmentally competent vs. incompetent oocytes using non-invasive procedures, thus ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ovarian fitness is often assessed by visualizing and quantifying follicles and oocytes. Because the ovary is an opaque three-dimensional tissue, traditional approaches require laboriously slicing the tissue into numerous serial sections in order to visualize cells throughout the entire organ. Furthermore, because quantification by this method typically entails scoring only a subset of the sections separated by the approximate diameter of an oocyte, it is prone to inaccuracy. Here, a protocol is described that instead utilizes whole organ tissue clearing and immunofluorescence staining of mouse ovaries to visualize follicles and oocytes. Compared to more traditional approaches, this protocol is advantageous for visualizing cells within the ovary for numerous reasons: 1) the ovary remains intact throughout sample preparation and processing; 2) small ovaries, which are difficult to section, can be examined with ease; 3) cellular quantification is more readily and accurately achieved; and 4) the whole organ imaged.

Here, we present a protocol to quantify follicles in cultured ovaries of young mice without serial sectioning. Using whole organ immunofluorescence and tissue clearing, physical sectioning is replaced with optical sectioning. This method of sample preparation and visualization maintains organ integrity and facilitates automated quantification of specific cells.

Todo Monte inmunofluorescencia y cuantificación del folículo de los ovarios de ratón cultivadas

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, regulation occurs at the hypothalamic-pituitary-gonadal axis level and on developing follicles in the ovary. Despite active studies, follicle development mechanisms are not clear because of the several steps involved from the dormant primordial follicle activation to ovulation, and because of the regulation complexity that differs at each follicular stage. To investigate the mechanisms of follicle development, and the dynamics of follicles throughout the estrus cycle, we developed a mouse ovarian tissue culture model that can be used to observe follicle development using a microscope. Systematic follicle development, periodical ovulation, and follicle atresia can all be reproduced in the cultured ovary model, and the culture conditions can be experimentally modulated. Here, we demonstrate the usefulness of this method in the study of the regulatory mechanisms of follicle development and other ovarian phenomena.

Ovarian tissue cultures can be used as models of follicle development, ovulation, and follicle atresia and indicate regulatory mechanisms of dynamic ovarian processes.

Cultivo de tejido ovárico para visualizar fenómenos en ovario de ratón

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

Whole Ovary Immunofluorescence, Clearing, and Multiphoton Microscopy for Quantitative 3D Analysis of the Developing Ovarian Reserve in Mouse

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells entering meiotic prophase I are eliminated during Fetal Oocyte Attrition (FOA) and the first week of postnatal life. Three major mechanisms regulate the number of oocytes that survive during development and establish the ovarian reserve in females entering puberty. In the first wave of oocyte loss, 30-50% of the oocytes are eliminated during early FOA, a phenomenon that is attributed to high Long interspersed nuclear element-1 (LINE-1) expression. The second wave of oocyte loss is the elimination of oocytes with meiotic defects by a meiotic quality checkpoint. The third wave of oocyte loss occurs perinatally during primordial follicle formation when some oocytes fail to form follicles. It remains unclear what regulates each of these three waves of oocyte loss and how they shape the ovarian reserve in either mice or humans.
Immunofluorescence and 3D visualization have opened a new avenue to image and analyze oocyte development in the context of the whole ovary rather than in less informative 2D sections. This article provides a comprehensive protocol for whole ovary immunostaining and optical clearing, yielding preparations for imaging using multiphoton microscopy and 3D modeling using commercially available software. It shows how this method can be used to show the dynamics of oocyte attrition during ovarian development in C57BL/6J mice and quantify oocyte loss during the three waves of oocyte elimination. This protocol can be applied to prenatal and early postnatal ovaries for oocyte visualization and quantification, as well as other quantitative approaches. Importantly, the protocol was strategically developed to accommodate high-throughput, reliable, and repeatable processing that can meet the needs in toxicology, clinical diagnostics, and genomic assays of ovarian function.

Here, we present an optimized protocol for imaging entire ovaries for quantitative and qualitative analyses using whole-mount immunostaining, multiphoton microscopy, and 3D visualization and analysis. This protocol accommodates high-throughput, reliable, and repeatable processing that is applicable for toxicology, clinical diagnostics, and genomic assays of ovarian function.

Inmunofluorescencia de ovario completo, limpieza y microscopía multifotónica para el análisis cuantitativo en 3D de la reserva ovárica en desarrollo en ratones

Female fertility and reproductive lifespan depend on the quality and quantity of the ovarian oocyte reserve. An estimated 80% of female germ cells ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells. In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Haploid gametes form through species-specific developmental programs that are coupled to meiosis. The first meiotic division (MI) is unique to meiosis because sister chromatids remain attached while homologous chromosomes are segregated. For reasons not fully understood, this reductional division is prone to errors and is more commonly the source of aneuploidy than errors in meiosis II (MII) or than errors in male meiosis 1,2. 
In mammals, oocytes arrest at prophase of MI with a large, intact germinal vesicle (GV; nucleus) and only resume meiosis when they receive ovulatory cues. Once meiosis resumes, oocytes complete MI and undergo an asymmetric cell division, arresting again at metaphase of MII. Eggs will not complete MII until they are fertilized by sperm. Oocytes also can undergo meiotic maturation using established in vitro culture conditions 3. Because generation of transgenic and gene-targeted mouse mutants is costly and can take long periods of time, manipulation of female gametes in vitro is a more economical and time-saving strategy. 
Here, we describe methods to isolate prophase-arrested oocytes from mice and for microinjection. Any material of choice may be introduced into the oocyte, but because meiotically-competent oocytes are transcriptionally silent 4,5 cRNA, and not DNA, must be injected for ectopic expression studies. To assess ploidy, we describe our conditions for in vitro maturation of oocytes to MII eggs. Historically, chromosome-spreading techniques are used for counting chromosome number 6. This method is technically challenging and is limited to only identifying hyperploidies. Here, we describe a method to determine hypo-and hyperploidies using intact eggs 7-8. This method uses monastrol, a kinesin-5 inhibitor, that collapses the bipolar spindle into a monopolar spindle 9 thus separating chromosomes such that individual kinetochores can readily be detected and counted by using an anti-CREST autoimmune serum. Because this method is performed in intact eggs, chromosomes are not lost due to operator error.

Oocytes are prone to aneuploidy due to errors in chromosome segregation during meiotic maturation. Aneuploid eggs can cause infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Here, we describe methods to introduce materials of choice into oocytes and methods to study meiotic maturation and assess ploidy.

La microinyección de ovocitos de ratón, Maduración y Evaluación de ploidía

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

Three-dimensional Reconstruction of the Vascular Architecture of the Passive CLARITY-cleared Mouse Ovary

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine system, but the complex structural relationships and three-dimensional (3D) vasculature architectures of the ovary are not well described. In order to visualize the 3D connections and architecture of blood vessels in the intact ovary, the first important step is to make the ovary optically clear. In order to avoid tissue shrinkage, we used the hydrogel fixation-based passive CLARITY (Clear Lipid-exchanged Acrylamide-hybridized Rigid Imaging/ Immunostaining/In situ-hybridization-compatible Tissue Hydrogel) protocol method to clear an intact ovary. Immunostaining, advanced multiphoton confocal microscopy, and 3D image-reconstructions were then used for the visualization of ovarian vessels and follicular capillaries. Using this approach, we showed a significant positive correlation (P &#60;0.01) between the length of the follicular capillaries and volume of the follicular wall.

Here we present an adaptation of the passive CLARITY and 3D reconstruction method for visualization of the ovarian vasculature and follicular capillaries in intact mouse ovaries.

Reconstrucción tridimensional de la arquitectura Vascular del ovario de ratón pasivo claridad-despejado

The ovary is the main organ of the female reproductive system and is essential for the production of female gametes and for controlling the endocrine ...

Desarrollo de un modelo de ratón ovariectomizado con un nivel elevado de FSH

Exploring Independent Effects of Follicle-Stimulating Hormone In Vivo in a Mouse Model

During the transition from a reproductive to a nonreproductive phase (menopause), many women experience significant physiological and pathological changes, including decreased bone mass, increased blood lipids, and increased visceral adiposity. Levels of follicle-stimulating hormone (FSH) rise during the menopausal transition. Many studies have shown that FSH in various extragonadal tissues and organs is associated with the pathogenesis of multiple diseases. Thus, building an animal model that can help study the independent effects of FSH in vivo is particularly important. In this study, C57BL/6 female mice were ovariectomized and supplemented with estradiol valerate (OVX + E2) to eliminate the effect of the hypothalamic-pituitary-gonadal axis. The OVX + E2 mice received solvent (N.S.) or different doses of recombinant FSH via intraperitoneal injection to create a mouse model (OVF) characterized by relatively stable estrogen and rising FSH levels. Thus, we successfully generated an experimental mouse model to mimic the early stage of menopause transition, characterized by elevated serum FSH levels. The OVF model has the advantages of being stable, low cost, and easy to operate, which is suitable for studies to explore the extragonadal actions of FSH. Here, we describe detailed protocols for the mouse OVF model.

Autor destacado: Investigación de la relación entre la FSH y los cambios fisiopatológicos en mujeres perimenopáusicas - Perspectivas de un modelo de ratón 

Follicle-stimulating hormone (FSH) in various extragonadal tissues and organs is associated with the pathogenesis of multiple diseases. The ovariectomized and FSH-treated mouse model (OVF) can be used to explore the extragonadal actions of FSH.