La investigación biomédica se enfrenta a una crisis de reproducibilidad en la que los nuevos hallazgos de la investigación rara vez se traducen en aplicaciones terapéuticas. Este protocolo reduce el factor humano e introduce la automatización y la estandarización en la fabricación. Este método se centra específicamente en hidrogeles fotoreticulables para aplicaciones de cultivo celular 3D, ya que los hidrogeles se han convertido en la plataforma más utilizada en modelos de tejidos de cáncer y otras enfermedades en la última década.
Hemos abordado con éxito las limitaciones actuales de hardware y software con el desarrollo de una plataforma tecnológica de código abierto. Esta plataforma ha sido diseñada específicamente para hidrogeles y permite flujos de trabajo de fabricación automatizados para la investigación de ingeniería de tejidos. Para instalar la API, abra la interfaz de línea de comandos.
Para instalar la API de trabajo, escriba pip install openworkstation y pulse Intro. Para operar el módulo de biofabricación de pipeteo, ingrese el comando para instalar la API de opentrons. A continuación, utilice la línea de comandos para abrir un script de Python y comprobar si ambas API se han instalado correctamente.
Para generar el código de protocolo, abra la aplicación de diseño de protocolo para generar un script de protocolo personalizado que será ejecutado por la plataforma. La interfaz se ejecuta en todos los navegadores de Internet de uso común. Escriba el nombre del protocolo en la página de configuración y haga clic en Continuar.
En la configuración de la bandeja de entrada, seleccione el bloque calefactor de tres por cuatro para definir la bandeja de entrada. Para definir los materiales y las concentraciones de existencias, seleccione Gel 1 en el menú Definir entradas e introduzca GelMA como nombre. Establezca la concentración de existencias en 20% y el número de muestras en tres y haga clic en Agregar para guardar las entradas y rellenar la primera columna.
Seleccione Gel 2 en el menú Definir entradas e introduzca Alginato como nombre. Establezca la concentración de existencias en 4% y el número de muestras en tres y haga clic en Agregar para guardar las entradas y rellenar la segunda columna. Después de configurar el fotoiniciador y los parámetros del diluyente como se muestra, seleccione la reticulación de la foto, establezca el tiempo en 30 segundos y la intensidad en dos y haga clic en Aceptar. A continuación, establezca el tipo de placa de pozo en placa de pozo 96 y haga clic en Grupo 1 para permitir que se especifiquen los parámetros para crear hidrogeles de doble red.
A continuación, marque la casilla Aplicar protocolo de mezcla avanzado si es necesario, establezca el número de muestras en 96 y haga clic en Continuar. Para establecer el diseño de la cubierta, seleccione el tipo de bandeja adecuado para cada ranura. Cuando se hayan seleccionado todos los tipos de bandejas, haga clic en el cuadro izquierdo de la pipeta y seleccione desplazamiento positivo de 10 a 100 microlitros en el menú desplegable.
Ajuste la velocidad de aspiración a 600 y la velocidad de dispensación a 800. A continuación, establezca los parámetros correctos de la pipeta de la misma manera. A continuación, haga clic en Generar protocolo para generar y guardar el script de protocolo.
Antes de ejecutar el protocolo, rocíe los consumibles con etanol al 70% y colóquelos de acuerdo con la configuración definida en la configuración del usuario. Coloque los tubos de reacción con los materiales en el bloque de aluminio en los muelles de temperatura de acuerdo con la configuración seleccionada. A continuación, rocíe sus guantes con etanol al 70% y abra los tubos de reacción con cuidado sin tocar los tubos abiertos.
Cuando las sustancias hayan alcanzado la temperatura experimental adecuada, ejecute el protocolo generado utilizando la interfaz de usuario. La estación de trabajo comenzará con el proceso de localización, seguido de obtener una placa de pozo vacía del módulo de almacenamiento. Después de quitar la tapa de la placa del pozo, la placa se transporta al siguiente módulo.
El protocolo especifica el volumen que se canaliza de cada solución madre y cambia automáticamente las puntas después de cada material para evitar la contaminación cruzada. Para mezclar soluciones viscosas de manera reproducible, la estación de trabajo ejecuta un protocolo de mezcla específico que ha sido optimizado para hidrogeles viscosos. La aplicación de diseño de protocolo tiene en cuenta el nivel de llenado del depósito y adapta automáticamente la altura de mezcla para evitar la inmersión innecesaria en los materiales viscosos.
Después de la generación automática de modelos 3D y placas de pozo, la estación de trabajo cierra la placa de pozo con la tapa nuevamente y almacena la placa de pozo en la posición programada en el módulo de almacenamiento. Una vez finalizado el protocolo, retire la placa del módulo de almacenamiento. Para la validación y verificación del protocolo realizado, cargue la placa en un espectrofotómetro y lea la absorbancia dos veces a 450 nanómetros.
Después de guardar los valores de absorbancia, abra el archivo de hoja de cálculo de análisis que se proporciona como material complementario en la publicación y copie las lecturas de absorbancia en la tabla de la hoja de datos sin procesar. Luego haga clic en la hoja de análisis para ver los valores medios, la desviación estándar y los valores del coeficiente de varianza, que se calculan y muestran automáticamente para una distribución de muestra uniforme para filas específicas y para columnas específicas de una placa de 96 pocillos. Para encontrar la configuración que garantice una alta reproducibilidad para las soluciones de glicerol, se generaron protocolos sin control de temperatura y sin toque de punta, con control de temperatura y sin toque de punta, o con control de temperatura y con toque de punta.
Los valores calculados del coeficiente de variación para las tres configuraciones revelaron una influencia significativa de la base de temperatura y la función táctil de punta, destacando la capacidad del protocolo para generar resultados altamente reproducibles cuando se utilizan ambas características. Utilizando la función de toque de punta con la base de temperatura, la desviación estándar se redujo significativamente en la configuración tres. El trazado de los valores de absorbancia de la muestra para la configuración tres no arrojó valores crecientes o decrecientes a lo largo del experimento y, por lo tanto, no indicó ninguna influencia de la posición de la muestra en los valores de absorbancia.
A continuación, se preparó una serie de dilución de GelMA diluyendo una solución madre de GelMA al 20% y evaluando las diferencias entre las diferentes diluciones de GelMA. El valor de absorbancia medido en cada paso de concentración fue significativamente diferente y la regresión lineal demostró un ajuste alto que confirma la capacidad de generar distintos pasos de concentración. Además, se evaluó la influencia del toque de punta para hidrogeles de doble red con 5%GelMA, 2%alginato y 0,15% LAP, que se generaron automáticamente con la configuración.
La integración del toque de punta da como resultado una disminución significativa de la desviación estándar que respalda la generación de un conjunto de datos reproducible. La visualización de los valores de absorbancia y los mapas de calor confirmaron la desviación reducida cuando se utiliza el toque de punta para eliminar el exceso de material de la punta. Nuestra tecnología permite la automatización de la fabricación de hidrogel para el cultivo celular 3D y la ingeniería de tejidos.
Es una solución de bajo costo para aumentar el rendimiento y la reproducibilidad de flujos de trabajo técnicamente desafiantes. Al proporcionar un enfoque de código abierto personalizable, esta tecnología allana el camino para la adaptación generalizada de la automatización de procesos en la investigación de ingeniería de tejidos.
