El accidente cerebrovascular es la principal causa de mortalidad y discapacidad en todo el mundo. Aunque la trombólisis y la extirpación quirúrgica de la oclusión vascular cerebral se pueden realizar en pacientes seleccionados, todavía hay una necesidad urgente de terapias eficaces contra el accidente cerebrovascular. Aquí, demostramos una administración intra arterial basada en catéter de células madre al hemisferio isquémico como un régimen potencial para la terapia de accidente cerebrovascular.
En primer lugar, presentamos cómo preparar el catéter de inyección y ganchos quirúrgicos. Diseñamos dos tipos de catéteres de inyección para la inyección intra-arterial. El diseño uno se utiliza para la inyección de una solución o suspensión que no requiere lavado del tubo.
El diseño dos permite la inyección de células madre neurales, seguido de un lavado del volumen muerto para entregar todo el volumen. Para construir un conjunto de catéteres de inyección, necesitará agujas de calibre 26 y calibre 20, una longitud de 10 a 15 centímetros de catéter MRE 25 y tres centímetros de longitud de catéteres MRE 50 y MRE 10. Corte ambas puntas de aguja y pula el extremo metálico en el papel de lija para reabrir el tubo y alisar los bordes y luego lavar con agua destilada para limpiar el agujero y lavar los desechos.
La figura muestra un extremo cerrado de una aguja de calibre 20 después de cortar la punta de la aguja, que se vuelve a abrir con un agujero liso después del pulido. Bajo un microscopio, inserte la aguja del calibre 20 en el extremo del tubo MRE 50. Doblar la aguja del calibre 26 y luego penetrar el tubo por debajo del extremo de la punta de la aguja del calibre 20.
Asegure la aguja del calibre 26 con súper pegamento. A continuación, incruste los dos cubos de aguja y el tubo y el epoxi para construir un bloque sólido para mejorar la resistencia. También necesitará tres ganchos quirúrgicos para mantener el tejido en posición para una mejor exposición de los sitios quirúrgicos.
Corte un eje de aguja de un centímetro y medio a dos centímetros de largo de una aguja de calibre 27 y pula ambos extremos en papel de lija hasta que estén apagados. Utilice una pequeña abrazadera hemostática para doblar el eje en un gancho en un extremo y en forma de anillo en el otro extremo. Inserte un catéter MRE 25 de 10 a 15 centímetros de largo a través del anillo y asegúrelo con cinta quirúrgica transparente.
Haga dos ganchos más usando el mismo método. Los ganchos y el sistema de catéter deben empaparse durante la noche en un setenta por ciento de etanol para la esterilización. Todos los procedimientos relacionados con sujetos animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Kentucky.
Utilizamos el cerebro embrionario de oto envolcido para cultivar células madre neuronales positivas. Los embriones positivos GFP se pueden visualizar fácilmente en el canal FITC en un microscopio fluorescente. Mientras que los embriones de tipo salvaje no muestran fluorescencia utilizando la misma exposición.
La autofluorescencia de embriones de tipo salvaje sólo es visible cuando el tiempo de exposición aumenta 100 veces. La corteza embrionaria se recoge y se utiliza para establecer cultivos de células madre neurales siguiendo el protocolo del fabricante. Estas células madre neurales pueden formar neuroesferas y pueden ser pasajes de más de 10 generaciones y pueden diferenciarse en glia son neuronas.
Panel de marcadores de células madre embrionarias como nanog, SSEA1, Oct4 y Sox3 se puede utilizar para identificar las propiedades de las células madre mientras que en las neuroesferas. Las neuroesferas se cultivaron en medios de comunicación, siguiendo el protocolo del fabricante y el uso entre los pasajes tres y cinco para la entrega de células madre neurales. El accidente cerebrovascular isquémico fue inducido en el hemisferio izquierdo tanto para ratones como para ratas, utilizando un filamento basado en filamentos, oclusión de la arteria cerebral media, MCAO con algunas modificaciones dependiendo de la especie.
En ratones, el filamento se inserta a través de la arteria carótida común, CCA y avanza en la arteria carótida interna, ICA. Mientras que en ratas, el filamento se introduce a través de la arteria carótida externa, ECA en el ICA debido al espacio de trabajo más grande. Aquí demostramos la cirugía de ratón.
Después de hacer una incisión de línea media a lo largo del cuello, separe los tejidos subyacentes usando disección contundente. Utilice los tres ganchos microquirúrgicos hechos de ejes de aguja de calibre 27 para lograr un mejor campo visual. El cuadrado negro indica el área quirúrgica para el siguiente paso.
La capa muscular por encima de la CCA izquierda está cuidadosamente abierta para exponer la CCA izquierda y el nervio vago. Siga el CCA hasta que alcance e identifique la bifurcación. Se debe tener precaución para no estirar, desplazar o apretar este nervio CCA o vago.
Abra cuidadosamente el tejido conectivo transparente, cubriendo la CCA y el nervio vago. Libera el espacio debajo de este CCA con una punta de los fórceps y aísla el tallo CCA tanto como sea posible. Enhebrar una sutura quirúrgica de nylon trenzado de seis O de doble cadena debajo de la CCA.
Corte el punto medio para dejar a las suturas subyacentes a la CCA. Coloque otra sutura de nylon debajo de la CCA. Ata un slipknot en la sutura superior, manteniéndolo suelto.
Separe las dos suturas inferiores. Ata un nudo deslizante con la sutura central, manteniéndolo suelto por ahora. Ate el nudo de un cirujano con una sutura inferior y muévalo al extremo proximal lo más lejos posible.
Recorta los extremos de la sutura. Exponer más a fondo el CCA más allá de la bifurcación. Empuje el slipknot suelto superior a la bifurcación y apriételo para evitar el flujo de sangre.
Poner la sutura MCAO de goma de silicio recubierta de 70 nylon junto a la CCA. Usando micro tijeras, corte una pequeña incisión en el CCA, junto al nudo inferior. Inserte la punta de la sutura MCAO en el CCA a través de esta incisión y avance hasta el nudo superior.
Ajuste la posición del nudo medio y apriételo hasta que pueda mantener la sutura MCAO en su posición. No apriete excesivamente el nudo. Suelte el nudo superior, pero haga otro nudo suelto en el mismo lugar.
Avance la sutura MCAO en el ICA. Confirme que la sutura MCAO pasa la bifurcación en el ICA. El camino de la sutura debe ser relativamente recto, entrando más profundamente en el tejido a medida que avanza.
Compruebe el marcador de plata en el extremo de la sutura. Asegúrese de que llega a la bifurcación. Compruebe de nuevo la dirección de la sutura MCAO.
Ajuste los nudos superior y medio para garantizar que no haya fugas de sangre. Avance aún más de la sutura MCAO, apriete los dos nudos superiores para asegurar la sutura MCAO en su lugar. Comience a registrar el tiempo durante una hora de isquemia.
Después de una hora de isquemia, anestesiamos al animal y reabrimos la herida de la piel. Exponga el área quirúrgica. Localice los mocos superiores y medios.
Suelte suavemente el nudo superior. Tire suavemente de la sutura MCAO hasta que la parte de goma de silicona blanca alcance el nudo medio. Apriete el nudo superior para mantener la sutura MCAO en su lugar para evitar el sangrado.
Suelte suavemente el moco central. Extraiga la sutura MCAO hasta que su extremo pase el nudo superior. Apriete el nudo superior.
Coloque el desliz medio justo encima de la incisión en la CCA. Apriete el moño medio. Retire el nudo superior.
Recorte los extremos de sutura del nudo medio. Cierre la herida de la piel y deje que el animal se recupere. Basándonos en nuestra experiencia, las células madre neurales se inyectan de forma segura a través de esta vía arterial entre uno y tres días después del accidente cerebrovascular.
Una vez más, hay variaciones menores entre las cirugías de ratón y rata para la inyección de células madre neurales. Y aquí demostramos la cirugía de ratón. En el tercer día después del accidente cerebrovascular, anestesia al animal, reabre la herida y vuelve a exponer la CCA.
Ponga una sutura quirúrgica de doble cadena debajo de la CCA y córtela en el punto medio para obtener dos suturas. Coloque las dos suturas correctamente. Haga un slipknot con la sutura superior.
Colóquelo justo debajo de la bifurcación. Apriete el slipknot superior. Haz otro slipknot con la sutura central.
Corte una pequeña incisión justo por encima del nudo recortado que queda de la cirugía de accidente cerebrovascular. Recorte la punta del catéter MRE 10 con un ángulo de aproximadamente 45 grados. Utilice este extremo afilado para entrar en la incisión en el CCA.
Tenga cuidado de ajustar correctamente el ángulo de entrada y la fuerza utilizada para insertar el catéter. De lo contrario, es posible que el catéter no entre en la CCA o que lo perfore. Inserte el catéter y avance hasta que la punta alcance el nudo superior.
Apriete el resbalón medio para mantener el catéter en su lugar y asegurar que no haya un enlace sanguíneo. Suelte el nudo superior. Haga un nudo deslizante con la sutura superior.
Ajuste el ángulo del catéter dentro del CCA y las posiciones de ambos nudos hasta que se alcance un rápido reflujo de sangre, lo que indica una comunicación exitosa entre el catéter y el flujo CCA. Encienda la bomba de la jeringa. La sangre en el catéter se enjuagará de nuevo en la CCA.
Termine la inyección después de cinco minutos. Liga el nudo superior. Suelte el nudo medio y retire el catéter.
Liga el nudo medio. Recorta todos los nudos. Cierre la herida y deje que el animal se recupere.
Después de la inyección intra-arterial, las células madre neurales etiquetadas por la GFP se encuentran principalmente en el hemisferio ipsilateral. Aquí, mostramos la distribución en el giro del dennato del hipocampo en un día después de la inyección. En el hemisferio ipsilateral, algunas de las células madre neurales positivas de la GFP localizadas en la corteza y el estriado, expresan doble cort, un marcador de neuronas inmaduras.
Estas son imágenes representativas de animales falsos y de accidente cerebrovascular con o sin inyección de células madre neurales a los siete días después de la inyección. A los 30 días del parto, solo se puede detectar una fluorescencia automática menor a través del canal FITC en los animales que reciben inyección del vehículo. Mientras que en las células madre inyectadas animales, GFP etiquetadas células madre neurales se pueden encontrar en el cerebro lesionado con la expresión de varios marcadores celulares como el marcador de gleo GFP o el marcador neuronal tujuan.
Las flechas blancas de cada imagen indican células madre neurales que expresan marcadores GFP o tujuan respectivamente. En conclusión, la inyección intra arterial es un método factible para la entrega de células madre neurales para la terapia de accidente cerebrovascular. Las células madre neurales pueden sobrevivir y diferenciarse en diferentes tipos de células dentro del cerebro lesionado.
Y por último, el método de inyección intra-arterial introducido aquí también se puede utilizar para la entrega de soluciones y suspensiones.
