Este protocolo es significativo porque ayuda a entender la farmacocinética del etanol en el desarrollo de embriones de pez cebra y esto ayudará a estandarizar los regímenes de exposición al etanol en estudios de peces cebra. La principal ventaja de nuestra técnica es que permite a los investigadores medir rápida y reproduciblemente los niveles de etanol durante el desarrollo embrionario, particularmente en embriones donde el suministro de sangre no está disponible. Este método se puede aplicar fácilmente a otros sistemas modelo, así como a otros factores ambientales asumiendo la técnica adecuada y la configuración del equipo.
Yo esperaría que las personas que realizan este protocolo por primera vez luchen con la velocidad necesaria para evitar la evaporación del etanol durante el procesamiento de embriones. Comience por transferir 10 embriones con líquido embrionario extra en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros marcados con una línea a un volumen de 250 microlitros. Agregue agua a la línea de relleno.
Prepare tubos de microcentrífuga adicionales para muestras descorionadas. Para eliminar el chorion, incubar los embriones en un plato de Petri de 100 milímetros con dos miligramos por mililitro de cóctel proteasa en medios embrionarios durante 10 minutos. Revuelva suavemente el plato cada pocos minutos para romper el coro.
Una vez que todos los embriones estén libres de la coral, retírelos del cóctel proteasa y lávelos dos veces con medios frescos. Luego transfiera los embriones a un plato fresco de 100 milímetros. Cuando todas las muestras estén listas para la medición del volumen, utilice una micropipeta P200 con la punta más pequeña posible para eliminar cuidadosamente todo el líquido alrededor de los embriones.
Pesar el agua con una báscula con menos de 0,1 miligramos de precisión, luego determinar el volumen de los 10 embriones restando el peso del agua eliminada de 250 microlitros. Para determinar el volumen de un solo embrión, divida la diferencia entre 10. Reúne los embriones de los tanques de apareamiento y colóquelos en un plato petri estándar de 100 milímetros y luego incuba el plato a 28,5 grados centígrados.
A las seis horas después de la fertilización, transfiera hasta 100 embriones a un nuevo plato con medios embrionarios y un 1% de etanol o medios solos. Cubra pero no selle los platos de Petri y colóquelos en una incubadora de 28,5 grados Celsius durante 18 horas o hasta que lleguen a las 24 horas después de la fertilización. Utilice dos micropipetas P200 en 50 microlitros y aspire la solución de cóctel proteasa en una y riegó en la segunda.
A continuación, coloque rápidamente 10 embriones en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros con una pipeta de vidrio y cierre la tapa. Repita este proceso para que todas las muestras sean probadas, controles y embriones tratados con etanol. Trabajando con una muestra a la vez, abra rápidamente la tapa y aspire todos los medios embrionarios residuales con una micropipeta P200 ajustada a 200 microlitros.
Agregue y retire rápidamente las 50 microlitros de agua, luego agregue las 50 microlitros del cóctel de proteasa y cierre la tapa del tubo. Deje reposar la muestra durante 10 minutos a temperatura ambiente y luego agregue rápidamente 450 microlitros de cinco molares de cloruro de sodio y cierre la tapa del tubo. Homogeneizar la muestra mediante vórtices durante 10 minutos y transferir dos microlitros de sobrenadante a un vial de cromatografía de gases.
Selle el vial con una tapa de politetrafluoroetileno. Después de completar el método de inicio, cargue 436 spME de etanol actual de dos a cinco minutos de ejecución RG. metanfetamina del menú de métodos en el software de análisis para cada muestra de la lista de muestras.
Rellene la lista de muestras comenzando con el aire, el agua y cinco espacios en blanco de cóctel de proteasa de cloruro sódico molar. A continuación, introduzca las normas de etanol en orden de 0.3125 a 40 milimolar. Siga las normas con la segunda ronda de espacios en blanco.
Introduzca todas las muestras de sobrenadantes embrionarios homogeneizados que se probarán de menor a mayor concentración de etanol prevista y termine entrando en una tercera ronda de espacios en blanco. Añadir los viales de cromatografía de gases al muestreador automático en el orden en que se introdujeron las muestras y dejar que se calienten durante 10 a 15 minutos. A continuación, inicie las ejecuciones de ejemplo con el software.
Una vez completadas todas las ejecuciones, active el método de apagado agregando una muestra final en la lista de ejemplo y ejecutando standby.meth. Realice una copia de seguridad de todos los datos adquiridos durante la ejecución de ejemplo. Una vez completado el método de apagado, haga clic en el cromatograma abierto y abra la carpeta con los resultados.
Las muestras se integran automáticamente en este programa. En los resultados, asegúrese de que se han integrado los picos correctos. Una vez confirmadas todas las muestras, imprima o exporte los resultados.
Trazar la altura máxima de los estándares de etanol en un gráfico y, a continuación, calcular los valores de pendiente, intercepción y y r al cuadrado. Obtenga el valor de etanol para cada muestra restando la altura máxima de la muestra de la intercepción y de las normas y dividiendo este valor por la pendiente de las normas. Para calcular la concentración de etanol en los embriones, calcule el factor de dilución para cada muestra y multiplique el valor de etanol de la muestra por este factor de dilución.
Por último, calcule las muestras de referencia de medios multiplicando el valor del etanol de los medios por un factor de dilución de 10. Para calcular adecuadamente las concentraciones de etanol embrionario, se midieron los volúmenes de embriones tanto en su coro como eliminados de su coro. En este análisis, el embrión comprendía el 56% del volumen total dentro de la tarea.
Sobre la base de trabajos publicados anteriormente, el 73,6% se utilizó como contenido de agua embrionaria para todos los análisis presentados. Esto dio lugar a agua que comprendía 0,82 microlitros de los 1,1 microlitros de volumen embrionario. Del volumen total de agua, el 49% está contenido en el embrión y el 51% en el líquido extraembiónónico.
Para el análisis de cromatografía de gases, se analizaron dos grupos de 15 muestras y los medios con los que fueron tratados medidos cinco veces por grupo. Los niveles medios de etanol fueron de 143,6 milimolares para el grupo uno y de 133,6 milimolar para el grupo dos. Las concentraciones de etanol de los embriones promediaron 63,5 milimolar y 53,1 milimolar para los grupos uno y dos respectivamente.
Se calculó una proporción de concentración de etanol embrionario con niveles medios de etanol para cada muestra. El grupo uno tenía el 44% de los niveles de etanol mediático, mientras que el grupo tenía el 40% de los niveles de etanol mediático. Los embriones de control no tratados se midieron a cero concentración de etanol medios militrolares.
Lo más importante a recordar al intentar este procedimiento es que procesar los embriones para el análisis de GC correctamente es crítico, ya que el etanol es volátil y se evaporará rápidamente. Se describe la mejor manera de realizar este paso, pero debe practicarse para desarrollar la memoria muscular adecuada. Este procedimiento ayudará a estandarizar los regímenes de tratamiento del etanol en el pez cebra y permitirá que los trabajos futuros diseccionen los mecanismos genéticos y celulares de la teratogenicidad etano.
