Recientemente, el papel de los pericitos cerebrales se ha hecho evidente en los trastornos neurológicos y la función cerebral. Por lo tanto, el desarrollo de un método confiable de cultivo para estas células es imperativo. Nuestro protocolo para la extracción de pericitos cerebrales murinos representa una herramienta fiable para estudios in vitro y para proporcionar pericitos de alta pureza y rendimiento celular.
Demostrando el procedimiento con Anupriya Mehra estará Lucie Dehouck, una técnica de mi laboratorio. Comience colocando el cerebro de un ratón C57BL/6 macho sin patógenos específico de cuatro a seis semanas de edad en una toallita estéril y libre de pelusas secas y usando fórceps de punta curvas para eliminar el cerebelo, el estriado y los nervios occipitales. Usa un hisopo de algodón para eliminar todas las meninges visibles y poner el tejido cerebral patas arriba.
Abra los lóbulos con golpes ligeros hacia afuera y retire todos los vasos sanguíneos visibles. A continuación, coloque el tejido cerebral libre de meninges en un plato de Petri de 100 milímetros que contenga 15 mililitros de tampón de lavado en frío B.To homogeneizar el tejido, transferir la muestra cerebral a un tubo de mortero de molienda de tejido Dounce y añadir de tres a cuatro mililitros de tampón de lavado B al tubo. Use un pestillo suelto para picar el tejido 55 veces, luego enjuague la plaga con el tampón B de lavado y picar la lechada de tejido con un pestillo apretado 25 veces.
Al final de la homogeneización, igualmente aliquot la loda entre dos tubos de 50 mililitros y añadir 1,5 veces el volumen de frío 30% de suero bovino albúmina dextran. A continuación, agitar vigorosamente los tubos para mezclar la suspensión. Para aislar la fracción vascular, sedimentar las células por centrifugación y transferir los sobrenadantes en dos nuevos tubos.
Almacene el pellet en la tampón de lavado B sobre hielo. Resuspender los pellets en tres mililitros de tampón de lavado en frío B sobre hielo. Centrifugar los sobrenadantes cosechados y repetir este paso más una vez más.
Desechar los sobrenadantes y resuspender los pellets en tres mililitros de tampón de lavado B.Then piscina los pellets resuspendidos y llevar el volumen final de la suspensión celular agrupada a 10 mililitros con tampón de lavado en frío fresco B.Más más disociar las células con una pipeta de 10 milímetros seis veces hasta que no se atenúen los grumos restantes de pellets y utilicen un conjunto de filtro de vacío y una coladora de malla de nylon. Coloque el colador en una placa De Petri y despeje la malla con el tampón de lavado fresco B y raspando para recuperar cualquier capilar. A continuación, realice una segunda filtración con un filtro fresco.
Divida el filtrado por igual entre dos tubos y recoja las células por centrifugación. Después de desechar los sobrenadantes, afires los pellets en un solo tubo que contenga tampón de lavado precalificado B con enzimas y agregue colágeno/dispase precalificado al tubo. Coloque el tubo en un baño de agua de mesa agitado durante exactamente 33 minutos a 37 grados Celsius antes de detener la reacción con 30 mililitros de tampón de lavado en frío B.Recoger las células por centrifugación y desechar cuidadosamente el sobrenadante.
Resuspender rápidamente pero con cuidado el pellet en el tampón de lavado B seis veces y centrifugar la suspensión de nuevo. Después de desechar el sobrenadante, resuspendir el pellet en 18 mililitros de medio DMEM completo y semilla de dos mililitros de suspensión celular en DMEM completo en nueve pozos de tres placas de seis pozos recubiertos de Matrigel. Coloque los cultivos celulares en una incubadora estéril de 37 grados Celsius 5% de dióxido de carbono durante 24 horas antes de retirar cuidadosamente los desechos de cada pozo y agregue medios DMEM frescos.
Después de 48 horas, cambie el medio en cada pozo cada 48 horas. En el día ocho a 10, cuando las células alcanzan el 100% de confluencia, pasa las células en el medio de cultivo de pericitos a nuevas placas recubiertas de gelatina de seis pozos y devuelve las células a la incubadora de cultivo celular durante seis a siete días adicionales con monitoreo. Luego divida las células de nuevo el día 17 en pericito medio en nuevas placas recubiertas de gelatina.
Desde el paso cero hasta el paso dos, existen características morfológicas específicas mediante las cuales se pueden identificar las células endoteliales y el posterior aumento gradual de los pericitos. En un cultivo de pasaje cero, las células endoteliales alargadas que se desarrollan a partir de microvajillones están en abundancia. Esta abundancia se reduce después del paso uno y ausente después del paso dos.
Por el contrario, los pericitos aparecen como células cuadriláteros raras en los primeros cultivos y se vuelven abundantes por el paso dos. La evaluación de la expresión de NG2, CD146 y PDGFR beta se puede utilizar para evaluar la pureza del cultivo de pericitos por PCR cuantitativo, inmunocitoquímica y mancha occidental. La digestión enzimática es un paso crítico para el éxito del protocolo.
Asegúrese de controlar estrictamente las concentraciones de enzimas y el tiempo de incubación.
