Las bacterias intracelulares secretan proteínas efectoras en el huésped que pueden manipular vías biológicas para promover la supervivencia de patógenos. Revelar los objetivos anfitriones de los efectores es esencial para entender patógenos intracelulares como Chlamydia trachomatis. La toxicidad de la levadura y las pantallas supresoras pueden proporcionar información clave sobre el objetivo biológico natural de las proteínas de efector bacteriano y pueden ser particularmente útiles cuando se desconoce un compañero de unión.
Aquí demostramos la toxicidad de la levadura y los ensayos supresores para el cribado de proteínas efectora Chlamydia trachomatis, pero esta técnica también se ha utilizado para caracterizar los efectos efectores de Legionella pneumophila y Coxiella burnetii. Comience por inocular cinco mililitros de caldo de abandono único con la única colonia de levadura transformada con la proteína efectora que contiene plásmido. Utilice la levadura transformada con el vector solo como control negativo e incubar el inóculo durante la noche a 30 grados centígrados mientras agita.
Al día siguiente, agregue 180 microlitros de agua estéril al A2 a través de pozos A6 de una placa de 96 pozos. Vórtice el cultivo nocturno y añadir 180 microlitros de levadura al pozo A1. A continuación, diluir en serie la levadura en los pozos con agua. Utilice una pipeta multicanal para detectar cinco microlitros de cada dilución en una sola glucosa desinstado y placas de agar de gata desinstado única e incubar las placas a 30 grados centígrados durante 48 horas.
Después de la incubación, evaluar visualmente la toxicidad comparando el crecimiento de la levadura expresando la proteína efectora cultivada en los medios que contienen gactosa con el crecimiento de levadura expresando el vector solo. Inocular 100 mililitros del caldo de abandono único con un mililitro del caldo de levadura previamente preparado e incubarlo durante 16 a 24 horas a 30 grados centígrados con temblores a 150 RPM. Al día siguiente, agregue los 100 mililitros enteros del cultivo nocturno a 900 mililitros de caldo de abandono único precalentó e incubar el matraz durante cuatro a cinco horas a 30 grados centígrados mientras agita.
Después de la incubación, pele el cultivo a 6.000 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y resusppend el pellet en 250 mililitros de agua estéril. Repita la centrifugación y deseche el sobrenadante.
Luego resuspender el pellet en 250 mililitros de un acetato de litio mililolar. Pele el cultivo por centrifugación, retire el acetato de litio y resusppend el pellet en 9,6 mililitros de 50%PEG 3350. A continuación, agregue reactivos de transformación como se describe en el manuscrito y ajuste el volumen a 15 mililitros con agua estéril invirtiendo suavemente para mezclar.
Incubar la mezcla a 30 grados centígrados durante 30 minutos. Luego agregue 750 microlitros de DMSO e incubar en un baño de agua a 42 grados Celsius durante otros 30 minutos. Agregar el DMSO antes del choque térmico es crucial para lograr una alta eficiencia de transformación.
Después de la incubación, peletizar la levadura centrifugando a 3.000 veces g durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y lave el pellet con 10 mililitros de agua estéril y luego repita la centrifugación para peletizar la levadura. Resuspender el pellet en ocho mililitros de agua.
Determine la eficiencia de la transformación diluyendo la muestra de uno a 10 y enchatando 100 microlitros de cada dilución en un agar de doble deserción. A continuación, la placa 200 microlitros de la muestra en placas de agar de gatactosa de doble deserción e incubar las placas a 30 grados centígrados durante 48 a 96 horas o hasta que aparezcan colonias. Una vez que las colonias hayan aparecido, parchearlas en el agar de gatactosa deserción doble e incubarlos durante otras 24 a 48 horas.
Utilice parte del parche para inocular cinco mililitros de caldo de goteo doble e incubar el inóculo durante la noche a 26 grados centígrados con temblores a 150 RPM. Al día siguiente, agregue 180 microlitros de agua estéril a cinco pozos de una placa de 96 pozos comenzando con el pozo A2. Vortex la mezcla de cultivo durante la noche. Añadir 180 microlitros de levadura al pozo A1 y diluir en serie utilizando el agua en los pozos A2 a A6. Detecte cinco microlitros de cada dilución en una sola deserción de glucosa y placas de ga gatactosa desinstado únicas, asegurándose de incluir el efector tóxico solo como control.
Incubar las placas a 30 grados celsius durante 48 horas y luego comparar el crecimiento de la levadura con el efector tóxico solo con el crecimiento de la levadura con el supresor potencial. Para confirmar los supresores que han demostrado una disminución de la toxicidad en comparación con el efector tóxico solo, aísle el plásmido de acuerdo con las instrucciones del manuscrito y vuelva a transformarlo en la levadura tóxica. Inocular caldo de glucosa de doble deserción con una colonia de la placa de transformación.
Incubarlo durante la noche y detectarlo en el agar de doble deserción glucosa y ga gatasa para confirmar la supresión de la toxicidad. Antes de realizar la pantalla supresora de levadura, las proteínas efectoras de interés se probaron para detectar toxicidad en levaduras. La proteína de interés se expresó en la levadura bajo el control de un promotor inducible de ga gactosa y el crecimiento de la ga gactosa se comparó con el crecimiento de la glucosa.
Cuando CT229 se probó para la toxicidad, se observaron colonias más pequeñas y supresión del crecimiento. Idealmente, se debe observar una disminución de dos a tres registros para proceder con las pantallas supresoras de levadura. La pantalla supresora se llevó a cabo transformando la cepa tóxica con la biblioteca genómica de levadura pYAP 13 y enchapando los transformantes en el agar gactosa.
Los clones supresores obtenidos fueron vistos en el agar de gactosa de abandono doble para confirmar la supresión de la toxicidad. Los supresores pSup1 y pSup2 suprimieron la toxicidad de la proteína efectora, mientras que pSup3 no. Estos procedimientos requieren una cuidadosa atención al detalle, además de los trabajos preparatorios críticos, incluyendo tener grandes cantidades de medios y placas listos antes de realizar el experimento.
Una vez identificados los supresores, se pueden realizar experimentos para verificar las interacciones con el efector de interés, incluyendo derribos, colocación de inmunofluorescencia, eliminación del efector o derribo de los factores del host identificados en las pantallas. El desarrollo de esta técnica para los efectores de la clamidia ha permitido la caracterización preliminar acelerada de las proteínas efectora y ha ayudado a centrar nuestros esfuerzos en el esclarecer los mecanismos moleculares subyacentes que median las interacciones de los patógenos del huésped.
