Nuestro protocolo proporciona un método de verificación mejorado para el quimerismo de circulación y un método para la configuración exitosa del modelo de parabiosis para la investigación biomédica. En comparación con los métodos existentes para la detección de quimerismo sanguíneo en parabiosis que a menudo son letales o engorrosos, nuestro protocolo es seguro y simple, permitiendo una verificación rápida y confiable. Aunque este método es específico para la detección de quimerismo sanguíneo en modelos de parabiosis, se puede aplicar a cualquier estudio biomédico que implique procedimientos parabióticos.
El paso más difícil es la inyección de glucosa. Por lo tanto, asegúrese de practicar la inyección de la vena de cola antes de realizar un procedimiento experimental, o utilice un fijador de cola de ratón visual venoso. Después de confirmar una falta de respuesta al reflejo del pedal, coloque dos ratones macho C57 negros de 20 a 25 gramos anestesiados en la posición supina, y utilice una afeitadora eléctrica para afeitar completamente el lado izquierdo de un ratón y el lado derecho del segundo ratón de aproximadamente un centímetro por encima del codo a un centímetro por debajo de la rodilla.
Retire cualquier cabello restante con crema depilatoria antes de hacer incisiones longitudinales de la piel en la piel despejada de cada animal, comenzando desde 0,5 centímetros por encima del codo hasta 0,5 centímetros por debajo de la articulación de la rodilla, y desenganche suavemente la piel de la fascia subcutánea. Conectar el olecranon y la rodilla del parabionte con sutura 3-0, y suturar la piel afeitada con una sutura continua 5-0. A continuación, inyectar por vía subcutánea 0,5 mililitros de cloruro de sodio 0,9% para prevenir la deshidratación, e inyectar por vía intramuscular 10 miligramos de tramadol por 25 gramos de ratón para aliviar el dolor, en cada ratón por día durante tres días.
Para verificar la construcción exitosa de la circulación entre el quimerismo entre los parabionts por fluctuación de glucosa, el día 10 después de la cirugía de parabiosis, asegurar los ratones donantes en un fijador de cola de ratón visual venoso, y utilizar una bola de algodón empapado de 70 a 75% de etanol para frotar las venas caudales en el flanco de una cola de parabionte. Inserte una aguja de jeringa de un mililitro en la vena caudal de dos a cuatro centímetros de la punta de la cola y en paralelo a la vena lo más posible, e inyecte de uno a dos gramos por kilogramo de glucosa en 100 microlitros de solución salina en el donante en un período de 10 segundos. A continuación, utilice tijeras para quitar los dedos de los dedos del donante y de los animales receptores para permitir la recolección de una gota de sangre en varios momentos de interés después de la inyección.
A continuación, agregue una gota de cada muestra de sangre en el centro de una tira reactiva de glucómetro para la detección del nivel de glucosa. Para verificar la construcción exitosa de la circulación por Evans de absorción de tinte azul, inyectar 200 microlitros de 0.5%Evans contrataja azul intraperitonealmente en el ratón donante, y recoger sangre de ambos parabintes por punción cardíaca después de dos horas. Separe el suero por centrifugación y transfiera el suero a un tubo cónico para su dilución en una proporción de uno a 50 en cloruro de sodio al 0,9%.
A continuación, mida la absorbancia de las muestras de suero diluidas a 620 nanómetros en un espectrofotómetro. En este análisis representativo de los niveles de glucosa en sangre en seis ratones donantes, la glucosa en sangre aumentó bruscamente a 26,5 micromolares por litro en un promedio de un minuto después de la inyección de 100 microlitros de glucosa a través de la vena de la cola. Los niveles de glucosa en sangre disminuyeron gradualmente a 13,3 microlitros por litro a los 60 minutos.
En ratones receptores, la glucosa en sangre aumentó lentamente después de la inyección, alcanzando el primer nivel máximo a los 15 minutos. La concentración de tinte azul Evans en el suero de parabiontes también indicó una construcción exitosa del quimerismo circulante, y se pudieron observar claramente las uniones vasculares subcutáneas entre los parabiontes. En los parabintes que no establecieron quimerismo sanguíneo 15 días después de la cirugía de parabiosis, los ratones receptores no presentaron un aumento del nivel de glucosa en sangre dentro de los 60 minutos posteriores a la inyección de glucosa en el animal donante.
La concentración sanguínea de Evans azul en los dos receptores tampoco fue elevada, lo que demuestra que el método de fluctuación de glucosa es tan sensible como el método azul Evans. Además, el nivel de insulina en sangre disminuyó notablemente una hora después de la inyección de glucosa debido al rápido aumento de los niveles de glucosa y se recuperó a niveles normales en tres horas, lo que indica que los efectos de la glucosa inyectada en el metabolismo de la insulina son restaurables. Tenga cuidado de asegurarse de que la aguja se inserta directamente en la vena de la cola.
Después de confirmar el quimerismo sanguíneo de los parabintes por este método, los cambios fisiopatológicos se pueden estudiar en animales parabióticos vivos.
