Este protocolo describe una técnica para apuntar a fármacos de interés para los macrófagos de peces cebra larvales para manipular y evaluar la función de los macrófagos. Esta técnica tiene ventajas sobre las estrategias tradicionales de administración de fármacos, como la inmersión, asegurando que los fármacos estén dirigidos específicamente a los macrófagos a través de la encapsulación de liposomas. Cuando se aplica a modelos de peces cebra de la enfermedad con un componente inflamatorio, esta técnica tiene el potencial de resolver cómo los macrófagos contribuyen a los procesos patológicos.
Aquí, demostramos la utilidad de esta técnica apuntando a un fármaco inhibidor de especies de oxígeno mitocondrial-reactivo a los macrófagos para suprimir la activación. La microinyección de liposomas cargados con drogas en larvas puede ser difícil, ya que se debe tener cuidado de no causar daño epitelial excesivo, lo que puede influir en los estudios inmunológicos. La demostración visual de este protocolo es importante porque implica metodologías farmacológicas y de células vivas de animales enteros que pueden no realizarse rutinariamente en un solo laboratorio.
Para preparar 10 miligramos de liposomas en un matraz de fondo redondo de 25 mililitros, agregue 31 nanomolares de azul marino y 300 nanomolares de un fármaco inhibidor de especies de oxígeno mitocondrial-reactivo al matraz. Sonicar brevemente para disolver completamente, y retirar el disolvente lentamente en un evaporador rotatorio sobre un baño de agua Celsius de 45 grados a 75 rotaciones por minuto bajo presión de vacío. Cuando se haya formado una película delgada de lípidos secos dentro de las paredes de vidrio del matraz, seque aún más la película durante 45 minutos bajo nitrógeno para facilitar la eliminación completa del disolvente orgánico.
A continuación, hidratar la película con un mililitro de PBS, y sellar el matraz con película de parafina antes de agitar el matraz a mano sobre un baño de agua Celsius de 60 grados durante 20 minutos. Después de siete ciclos de congelación y descongelación, utilice un mini-extrusor y membranas de policarbonato grabado por orugas de un micrómetro para extruir los liposomas durante dos a seis ciclos. Cuando se hayan obtenido grandes vesículas unilamelares, condense los liposomas frescos en un pellet por ultracentrifugación.
Incubar el pellet con un mililitro de 1%poloxamer 188 solución durante 30 minutos a 45 grados Celsius y 750 rotaciones por minuto en un ThermoMixer con un accesorio de tubo de microcentrífuga de dos mililitros. Durante la inserción posterior del poloxámero 188 en los liposomas, la concentración correcta de poloxómeros, el tiempo de incubación y la temperatura son importantes para lograr las características fisicoquímicas óptimas de los liposomas resultantes. Al final de la incubación, ultracentrifríe la mezcla de nuevo en las mismas condiciones de centrífuga, y retire el sobrenadante que contiene cualquier polímero o medicamento sin límites.
A continuación, almacene los gránulos liposomas en cuatro grados centígrados, protegidos de la luz. Para determinar el tamaño y el potencial zeta de los liposomas, diluir la formulación de liposomas con agua ultrapura en una proporción de uno a 100. Utilice un analizador de dispersión de luz dinámica para medir el tamaño de partícula, el índice de polidispersidad y el potencial zeta en triplicado a 25 grados centígrados.
Para calcular la eficiencia de atrapamiento y la carga de fármacos de los liposomas, disolver los liposomas en Triton X-100. Inyecte 20 microlitros de la muestra de liposoma disuelto en un sistema de cromatografía líquida de alta presión con una bomba cuaternaria, un detector de matriz de diodos establecido en 230 nanómetros y una columna de tres micrómetros de 250 veces-4,6 milímetros. Para preparar larvas de pez cebra transgénicas para la inyección, utilice fórceps de punta fina para descorionar manualmente 30 horas después de la fertilización, y permitir que los embriones se desarrollen a 28,5 grados centígrados hasta dos días después de la fertilización.
Cuando los embriones hayan alcanzado la etapa adecuada, diluir una formulación de liposoma recién preparada en una proporción de uno a uno en PBS estéril, y mezclar la solución durante dos a tres segundos por vórtice. Vierta suficiente 3%celulosa de metilo en E3 medio en la tapa de una pequeña tapa de 35 milímetros para formar una película delgada que cubra toda la superficie. Utilice una pipeta de transferencia de plástico para recoger un grupo de aproximadamente 20 a 25 larvas anestesiadas.
Permita que los embriones se concentren en la punta de la pipeta por gravedad, y transfiera cuidadosamente las larvas a la mitad de la tapa del plato de cultivo de 35 milímetros con una solución mínima. Utilice un cargador microcapilar para colocar las larvas con sus anteriores hacia la parte superior de la placa de inyección con la superficie dorsal orientada hacia la aguja de microinyección para inyección en el ventrículo del cerebro posterior o con sus anteriores hacia la izquierda de la placa de inyección con las superficies ventrales orientadas hacia la aguja de microinyección para inyección en el venoso sinusal. Utilice un cargador microcapilar para rellenar una aguja de inyección con aproximadamente cinco microlitros de la mezcla de inyección de liposomas.
Monte la aguja en un micromaniprulador conectado a un soporte magnético y un inyector de presión, y coloque la configuración bajo un microscopio estéreo. Utilice fórceps limpios y de punta fina para cortar la punta de la aguja de microinyección para generar una abertura de aproximadamente cinco micrómetros de diámetro. Ajuste el inyector a una duración de pulso de aproximadamente 50 milisegundos y una presión de inyección de aproximadamente 40 libras por pulgada cuadrada.
Inyecte un bolo en una gota de aceite mineral colocada sobre las líneas de rejilla de un hemocitoómetro para calibrar el volumen que se va a inyectar. A continuación, ajuste la duración del pulso y/o la presión de inyección hasta que el diámetro del bolo cubra 2 1/2 de las líneas de rejilla más pequeñas. Inyecte cuidadosamente un nanolitros de la mezcla de inyección de liposomas en el ventrículo de la hindbra de cada larva.
Inmediatamente después de las inyecciones, agregue el medio E3 a la placa de inyección y utilice una pipeta de transferencia de plástico para agitar suavemente las larvas fuera de la celulosa metilo. Para imaginar la superficie dorsal del cerebro trasero en un microscopio confocal equipado con una lente de inmersión en agua, primero llene un plato de cultivo de 35 milímetros a una profundidad de cinco milímetros con medio de montaje, y deje que el medio se polimerice. Excavar una pequeña zanja en la agarosa de área suficiente para acomodar el saco de yema del embrión experimental, y utilizar una pipeta de transferencia de plástico llena de medio de montaje fundido para recoger una larva anestesiada.
Deposite inmediatamente la larva en el plato de cultivo, y utilice un cargador microcapilar para orientar el lado ventral del saco de yema hacia abajo en los agujeros excavados. Mantener el embrión en esta posición hasta que la agarosa se polimerice. Superponer el embrión con un medio E3 complementado con 200 microgramos por mililitro de tricaína.
Para obtener una imagen en vivo del ventrículo de la hindbra, seleccione el objetivo 20x y establezca el microscopio confocal en 512 por 512 píxeles y un zoom de 2,5x. Cuando se hayan establecido los parámetros del microscopio, adquiera pilas Z de 40 por tres micrómetros que se extienden desde la superficie dorsal del cerebro trasero utilizando imágenes de dos canales para crear imágenes de los liposomas fluorescentes azules y los macrófagos fluorescentes verdes. Una vez obtenidas todas las imágenes, cargue los archivos en un programa de software de análisis de imágenes 3D adecuado.
En la pestaña Medición, arrastre el protocolo Buscar objetos al espacio Arrastrar tareas aquí para realizar mediciones. Seleccione el canal DAPI para resaltar los liposomas y arrastre la herramienta Inspeccionar a través de las secciones Z para detectar los macrófagos cargados de liposomas. Para cuantificar la intensidad de fluorescencia de los liposomas dentro de las celdas individuales, arrastre el protocolo Recortar a regiones de interés al espacio Arrastrar tareas aquí para realizar mediciones y utilice la herramienta Rectángulo para dibujar un cuadro alrededor de la celda de interés en las dimensiones X, Y y Z.
A continuación, seleccione Crear elemento de medición en el menú desplegable Dimensiones para generar un archivo de medición en la ventana de la biblioteca. En esta tabla, se resume el tamaño, el potencial de zeta, la carga de fármacos y la eficiencia de atrapamiento de los liposomas producidos. Como se observó, el tamaño de partícula de los liposomas es similar con y sin carga de drogas, aunque la carga superficial de liposomas cargados con drogas es ligeramente más neutral que los liposomas de control con azul marino solamente.
La microinyección de liposomas marinos de etiqueta azul en el ventrículo de la hindbrain, como se ha demostrado, da como resultado una rápida absorción por parte de los macrófagos residentes que se pueden cuantificar fácilmente mediante microscopía confocal por tres horas después de la inyección. Sin embargo, rara vez se observa que los neutrófilos contienen liposomas intracelulares. Dentro de los macrófagos individuales cargados de liposomas, los liposomas se acumulan dentro de los compartimentos fagososomales, que es necesario para la degradación del liposoma y la posterior liberación de contenido farmacológico en el citoplasma.
La entrega en el sinusal venoso puede entregar los liposomas a los macrófagos caudales residentes en el tejido hematopoyético a través de la circulación. La microinyección de liposomas cargados con el fármaco inhibidor de las especies de oxígeno mitocondrial-reactivo en el ventrículo de la hindbraína puede suprimir significativamente la producción de especies de oxígeno mitocondrial-reactivas impulsadas por cristal de urato monosódico dentro de los macrófagos residentes en el cerebro trasero liposomas. La validación adicional de los efectos supresores de los fármacos de interés en los estados de activación de macrófagos se puede realizar investigando la expresión génica proinflamatoria de citoquinas mediante la hibridación in situ de todo el monte y el reclutamiento temporal de neutrófilos.
Usando esta técnica, hemos sido capaces de dirigir fármacos a los macrófagos para confirmar que un mecanismo inmunometabólico impulsa su activación en un modelo larval de pez cebra de inflamación aguda de gota. Las adaptaciones futuras de este protocolo podrían incluir la modificación de la superficie del liposoma para mejorar la focalización de los macrófagos o para promover la orientación a otras células inmunitarias, como los neutrófilos.
