Este protocolo es significativo porque ofrece el primer modelo de inflamación sensibilizado lesión cerebral prematura en los hurones que resulta en lesiones significativas y sostenidas. Esta técnica implica un insulto prolongado que incorpora muchos de los desencadenantes y mecanismos bioquímicos que se cree que contribuyen a los tipos de lesiones cerebrales observadas en bebés humanos prematuros. Demostrando el procedimiento de medición cerebral estará Kylie Corry, una científica de investigación en nuestro laboratorio y Olivia White, una estudiante de pregrado.
Treinta minutos antes de comenzar la cirugía, administrar tres miligramos por kilogramo LPS IP a kits en el grupo de lesiones y un volumen equivalente de solución salina estéril de tres microlitros por gramo para controlar a los animales. Antes de comenzar el procedimiento, utilice pequeños cortadores de animales para eliminar todo el cabello en la región del cuello ventral del hurón en un patrón rectangular, teniendo cuidado de evitar morder la piel o generar erupción por calor. Administrar anestesia local en la zona afeitada y desinfectar la piel con tres hisopos alternos de yodo de povidona y setenta por ciento de etanol.
Después de confirmar un nivel adecuado de sedación por pellizco de los dedos de los dedos, cubra al animal con cortinas de corte estériles y desechables que expongan la región del cuello. Para la ligadura de la arteria carótida bilateral, utilice una hoja de un solo uso de diez bisturíes para hacer una incisión de línea media de 1,5 centímetros en el centro del cuello y utilice hemosatos finos y fórceps curvos para diseccionar sin rodeos hacia la arteria carótida izquierda. Disecciona la arteria expuesta lejos del haz neurovascular asociado.
Y usa un par de fórceps finos curvados para pasar una longitud de diez centímetros en bucle de sutura de seda estéril 5/0 debajo de la arteria. Cortar la sutura por la mitad y atar firmemente ambas longitudes de sutura para ligar la arteria, dejando al menos dos milímetros entre los nudos. Transecta la arteria carótida izquierda entre las suturas, teniendo cuidado de dejar el nervio intacto y repetir la disección a la derecha.
Ligar reversiblemente la arteria carótida derecha con una sola corbata estéril estéril de 1/8 pulgadas. Y cierra la herida con clips quirúrgicos de la piel. Luego, deje que el animal se recupere en un baño de agua con temperatura controlada durante al menos treinta minutos con monitoreo antes de la hipoxia.
Para el tratamiento secuencial de hipoxia, hiperoxia e hipoxia, coloque a los animales en el grupo de lesiones en una cámara hermética dentro de un baño de agua. Monitorear continuamente la concentración de oxígeno dentro de la cámara, así como la temperatura rectal en al menos un animal centinela. Enjuague la cámara con oxígeno humidificado al nueve por ciento y al 91 por ciento de nitrógeno y mantenga un caudal de tres a cinco litros por minuto, dependiendo del tamaño de la cámara.
Una vez que la concentración de oxígeno en la cámara ha alcanzado el nueve por ciento, continuar la entrega durante treinta minutos. Al final del tratamiento de hipoxia, cambie el suministro de gas al 80 por ciento de oxígeno humidificado y al 20 por ciento de nitrógeno. Después de treinta minutos de hiperoxia, abra la cámara para permitir que llegue más rápidamente a la normoxia, equilibrando con el aire de la habitación, antes de sellar la cámara y enjuagar con nueve por ciento de oxígeno humidificado de nuevo.
Monitoree continuamente todos los animales durante esta segunda ronda de hipoxia, tomando nota de los animales que muestren bradipnea. Una vez que la concentración de oxígeno en la cámara ha alcanzado el nueve por ciento, continuar el tratamiento de hipoxia durante treinta minutos. Al final del tratamiento, se utilizaron fórceps curvos para identificar y desatar la cinta umbilical de la arteria carótida derecha.
Cierre la herida con clips quirúrgicos de la piel. Luego devuelva todos los kits a las jills durante 60 minutos para la lactancia y la recuperación. Al final del período de recuperación, devuelva a los animales heridos a los baños de agua a 37 a 40 grados centígrados durante seis horas, ajustando la temperatura del agua según sea necesario, para mantener temperaturas rectales de 36 a 37 grados centígrados.
Luego, devuelva los kits a sus jills otra vez. Después de la cosecha y fijación cerebral en el punto final experimental apropiado, coloque las puntas de una pinza electrónica en los aspectos dorsal y ventral de cada cerebro para medir la altura de cada cerebro lesionado y no lesionado. Coloque las puntas de la pinza en las porciones más laterales de los lóbulos temporales para medir el ancho de cada cerebro y pesar cada cerebro.
Utilice el calibrador para medir la fisura longitudinal, todos los sulci desde el principio y el final de la porción más distinta del sulcus correspondiente, y todo el gyri desde el aspecto más amplio de cada giro correspondiente. A continuación, coloque una punta de la pinza en el punto más posterior de la fisura longitudinal y la otra punta de la pinza en la parte más posterior del cerebelo para medir la cantidad de cerebelo expuesto. De los 34 animales de seis camadas expuestas al insulto en este estudio, cinco animales tenían lesiones moderadas y cuatro animales tenían lesiones graves.
Con el aumento de la lesión, se observa estrechamiento del giro en los lóbulos temporales y/o occipitales, con un acortamiento y ensanchamiento de la fisura longitudinal y áreas más grandes de pérdida de tejido quístico en los animales más gravemente heridos. Durante el período de prueba de reflejos, los animales lesionados muestran un tiempo más lento para rotar en la tarea de geotaxis negativa. Un tiempo más lento para girar lejos del borde en la tarea de aversión de acantilado y un tiempo más lento para la derecha.
En la pasarela, los animales lesionados demuestran una velocidad media similar a los controles, pero muestran un grado significativamente mayor de variación de velocidad durante cada carrera. La distancia ajustada por peso entre las patas y las patas traseras es significativamente mayor en los animales heridos, con menos presión ejercida por unidad de área de la pata, a través de las cuatro patas. En campo abierto, los animales heridos cubren menos distancia total, se detienen con más frecuencia y pasan mucho más tiempo en el centro del campo y menos tiempo en las esquinas.
Aquí, se pueden observar mapas de calor representativos de los animales de control y heridos. Tenga cuidado de diseccionar la arteria del nervio que lo acompaña y permitir el máximo tiempo posible de hipoxia. Estas medidas garantizarán que la mayoría de los animales sobrevivan, al mismo tiempo que sufren una lesión.
Después de este procedimiento, se pueden evaluar los resultados bioquímicos, patológicos o conductuales, incluidas las evaluaciones que normalmente se limitan a los modelos de roedores de lesión cerebral.
