Los endocannabinoides son mediadores lipídicos conservados que regulan múltiples procesos biológicos en una variedad de organismos. Los primeros endocannabinoides descubiertos son anandamida y 2-arachidonoylglycerol, 2-AG. El nematodo C.elegans es un potente modelo animal para estudiar una gran variedad de procesos biológicos.
Recientemente, descubrimos que 2-AG desempeña un papel fundamental en la regulación del tráfico de colesterol en C.elegans. Es por esto que se hizo imperativo diseñar y optimizar un método para estudiar endógeno 2-AG mediante la detección y cuantificación en C.elegans. Los métodos analíticos previamente notificados para cuantificar 2-AG en muestras biológicas generalmente implican el uso de normas deuterated que son comerciales adquiridas están obligados a tenerlos disponibles para su compra.
Sin embargo, son caros, y debido a la presencia de múltiples enlaces dobles, son sensibles a oxidarse con el tiempo. La versión más común de las normas se basa en el ácido araquidónico octadeuterated siendo adecuado para la cuantificación por dilución de isótopos, por cromatografía líquida, y espectroscopia de masa posterior. Para superar las dificultades asociadas al costo y estabilidad de las normas deuterificadas para cuantificar 2-AG, utilizamos un método cómodo y sencillo para preparar un estándar analítico basado en el deuterio-5-glicerol.
La secuencia para preparar el estándar pendeuterated requiere un procedimiento de tres pasos. Ser posible mantenerse en la forma protegida hasta que sea necesario. El objetivo principal de este trabajo es mostrar un método completo para estudiar 2-AG en C.elegans desde la síntesis del estándar analítico deuterated hasta la preparación y extracción de las muestras de nematodos y, por último, el análisis por cromatografía líquida y espectroscopia de masas.
Para obtener 1-AG deuterated como un estándar interno deuterated para ensayos de cuantificación, siga un protocolo de tres pasos. Con el fin de proteger únicamente los alcoholes primarios, primero agregue 38 miligramos de glicerol deuterated a un tubo de reacción de 10 mililitros utilizando una pipeta Pasteur y agregue un agitador magnético. A continuación, agregue cinco mililitros de DCM anhidro utilizando una jeringa Hamilton de cinco mililitros y llene el tubo con nitrógeno seco para dar una atmósfera inerte.
Prepare un baño con un matraz Dewar poco profundo lleno de acetato de etilo destilado. Llene el tubo de reacción herméticamente cerrado dentro del baño y enfríelo añadiendo lentamente nitrógeno líquido al acetato de etilo hasta que el disolvente se congele. Precaución, el líquido hierve violentamente a temperatura ambiente y puede causar quemaduras graves si está en contacto con los ojos y la piel.
A continuación, agregue 54 miligramos de collidina anhidra usando una jeringa de Hamilton. Precaución, collidina es volátil y tiene un olor muy fuerte y desagradable. A 70 miligramos de terbutile-dimetil-cetilcloruro y remueva todo durante tres horas a menos 78 grados en un agitador magnético.
Añadir dos mililitros de salmuera para apagar la reacción. Extraer la solución con dos mililitros de diclorometano destilado tres veces utilizando un embudo separado manteniendo los extractos orgánicos cada vez. A continuación, combine los tres extractos orgánicos y seque sobre el sulfito de sodio.
Purificar la mezcla bruta por cromatografía de columna utilizando gel de sílice como fase estacionaria y un gradiente de acetato de etilo de hexano 10% a partir de 100% hexano y terminando con acetato de etilo 100%. Para este paso de esterificación, añadir 10 miligramos del producto previamente indicado a un tubo de reacción de 10 mililitros utilizando un pipte Pasteur y añadir un agitador magnético. Añadir dos mililitros de DCM anhidro utilizando una jeringa Hamilton de cinco mililitros y llenar el tubo con nitrógeno seco para dar una atmósfera inerte.
Enfríe la solución a cero grados usando un baño de hielo. Ad 36 miligramos de ácido araquidónico usando una micropipeta ajustable multivolta por volumen y revuelva. Luego, añadir 15 miligramos de 40-metil-aminopiridina y remover.
Agregue 15 miligramos de diacylpropylcarbodiimid usando una micropipeta ajustable multivoltave y revuelva. Añadir dos mililitros de agua para apagar la reacción y luego extraer la solución con dos mililitros de DCM destilado tres veces utilizando un embudo de separación. Combinar los tres extractos orgánicos y sulfito de sodio seco sobre sodio, purificar la mezcla bruta por cromatografía de columna utilizando gel de sílice como fase estacionaria y luego un 10% aumento del gradiente de acetato de etilo de hexano a partir de 100% hexano y terminando con 50 50%acetato de etilo de hexano.
Finalmente, para el paso de desprotección, añadir 15 miligramos del producto previamente sintetizado a un tubo de reacción de 10 mililitros utilizando una pipeta Pasteur y añadir un agitador magnético. Añadir dos mililitros de tetrahidrofurano anhidro utilizando una jeringa Hamilton de cinco mililitros y llenar el tubo con nitrógeno seco para dar una atmósfera inerte. A continuación, enfríe la solución a cero grados usando un baño de hielo.
Añadir 150 microlitros gotas de una solución molar de fluoruro de tetrabutilamonio en THF utilizando una jeringa Hamilton. Después de una hora, agregue dos mililitros de agua para apagar la reacción. Extraiga la solución con dos mililitros destilados DCM tres veces utilizando un embudo de separación.
Combine los tres extractos orgánicos y seque sobre el sulfito de sodio. Para el procedimiento de blanqueo, gire los gusanos en placas NGM de seis centímetros de semilla. Deje que el gusano crezca de dos a tres días para que haya muchos huevos y adultos gravid en el plato.
Una vez que tenga un montón de huevos y adultos, vierta cinco mililitros de M9 en el plato. Con una pipeta de vidrio, transfiera los gusanos a un tubo de halcón de 15 mililitros. Centrifugar el tubo durante dos minutos a 2.000 G y peletizar los gusanos.
Succiona la mayor parte del M9 sin alterar el pellet de gusano. Agregue tres mililitros de solución de blanqueo y mezcle la solución suavemente invirtiendo durante aproximadamente cinco minutos o hasta que vea una disminución en el número de gusanos adultos intactos. Una vez que la mayoría de los cuerpos se han disuelto, centrifugar a 2.000 G durante un minuto.
Succionar la mayor parte de la solución de blanqueo sin alterar el pellet de gusano. Añadir 15 mililitros de M9 al tubo y mezclar bien. Centrifugar de nuevo a 2.000 G durante un minuto.
Succiona la mayor parte del M9 sin alterar el pellet de gusano. Para la preparación de muestras de gusanos, deje que los embriones N2 obtenidos por procedimiento de blanqueo tuvieron durante la noche en tampón M9 a 20 grados. Luego, cosecha L1s sincronizados centrifugando el tubo dos minutos a 2.000 G.Lave los gusanos con Tampón M9 una vez más y cuantifique el número de L1 vivo. Semilla de aproximadamente 10.000 gusanos en placas NGM con un mililitro de OP 50 Escherichia coli previamente secados.
Incubar las placas al menos durante 48 horas a 20 grados hasta que los gusanos alcancen la etapa L4. Cosecha los gusanos usando un tampón M9 frío en un tubo de halcón de 50 mililitros. Lávelos una vez más y transfiéralos a un tubo de 1,5 mililitros.
Pele los gusanos por centrifugación a 2.000 G durante un minuto. Elimine la mayor parte del sobrenadante. A continuación, sumerja el tubo en nitrógeno líquido y revuelva a menos 80 grados.
Descongelar aproximadamente 100 microlitros de pellets de gusano congelados pertenecientes a N2 y luego añadir 1,3 mililitros de metanol. Después de eso, sonicar la muestra durante cuatro minutos. Después de la sonicación, agregue 1.000 ppb del estándar interno deuterated, 2,6 mililitros de cloroformo y 1,3 mililitros de 0,5 molares de cloruro de potasio, 0,08 molares de ácido fosfórico a una proporción final de uno a uno.
Vórtice las muestras durante un minuto y luego sonicarlas en un baño de agua ultrasónica durante 15 minutos sobre hielo. Vórtice las muestras de nuevo dos veces durante un minuto y centrifugarlas durante 10 minutos a 2.000 G para inducir la separación de fase. Recoger la fase inferior en un tubo de vidrio limpio, secarlo bajo nitrógeno y resuspendrlo en 100 microlitros de acetonitrilo.
Para lograr una cuantificación exitosa del endógeno 2-AG, era necesario sintetizar su análogo saturado utilizando un método de tres pasos. Posteriormente, se añadió a muestras de gusanos, extraídas y analizadas por cromatografía líquida de alto rendimiento, acopladas a espectrometría de masas. Utilizado como estándar interno, el sintético deuterated 1-AG fue la herramienta para cuantificar el metabolito endógeno.
El método se optimizó utilizando las transiciones para 2-AG y para 1-AG deuterated donde se pierden moléculas de glicerol. 2-AG endógeno de las muestras de C.elegans fue detectado y cuantificado con éxito por dilución isotópica con el 1-AG sintetizado químicamente utilizando cromatografía líquida de alto rendimiento acoplada a espectrometría de masas. La muestra uno se preparó con el estándar deuterated 1-AG, mientras que la muestra dos sin el estándar.
Dado que la concentración original del estándar deutado en la muestra uno y tres era de 1.000 ppb cada una, a partir de la relación de área máxima es posible calcular la concentración endógena de 2-AG en la muestra de 340 ppb para la muestra uno y 360 ppb para la muestra tres, dando una media de 350 ppb. Las relaciones se calcularon como una calidad entre las áreas pico de 2-AG y 1-AG deuterated, respectivamente, para dos muestras aisladas. Ambos con el estándar deuterated añadido antes de la extracción.
Dada la importancia recientemente descubierta de 2-AG en la mejora del tráfico de colesterol y la falta de información de cómo los lípidos influyen en ese proceso, era necesario un método de detección confiable para este endocannabinoide. El desarrollo exitoso de un método sintético simple y robusto reportado aquí para obtener analógico deuterated 2-AG fue un paso clave de este protocolo. La mayoría de los métodos notificados para cuantificar los monoacylglycerols implican el uso de normas analíticas disponibles comercialmente, que suelen ser costosas e inestables en condiciones de almacenamiento regulares, lo que las convierte en inalcanzables para laboratorios de menor presupuesto.
Sin embargo, este método resuelve esto proponiendo una síntesis de la norma utilizando materiales de partida más accesibles. El método sintético es directo sin condiciones sofisticadas necesarias, por lo que es ideal para realizar en cualquier laboratorio con un equipo mínimo y acceso a los reactivos, incluso con un presupuesto reducido. En resumen, este nuevo procedimiento describe una forma directa y reproducible de detectar y cuantificar 2-AG que ayudará a responder a algunas de las preguntas planteadas después de la descripción del papel de estos endocannabinoides en el tráfico de colesterol en C.elegans.
