Investigar la interacción proteína-proteína es indispensable para comprender los procesos fisiológicos en varios campos. En este vídeo introducimos la técnica de digestión en la membrana que permite a los investigadores realizar un análisis exhaustivo de las proteínas de unión por LA MS de una manera conveniente. La principal ventaja de esta técnica es que podemos mejorar el rendimiento del análisis proteómico para inmunoprecipitantes crudos porque no es necesaria la separación de proteínas por electroforesis de gel de poliacrilamida.
Comience a conjugar el anticuerpo con las perlas magnéticas, mezclando el anticuerpo anti-GFP con las perlas en 500 microlitros de tampón de fosfato de citrato. Gire la mezcla a 50 RPM durante una hora a temperatura ambiente. Y luego lavar las cuentas conjugadas tres veces con tampón de fosfato de citrato que contiene 1%polisorbato 20.
Lyse células trans infectadas de acuerdo con las instrucciones del manuscrito. Raspa el plato y transfiere el izado al tubo de ensayo de 1,5 mililitros. A continuación, despeje el izado centrifugando a 15.000 x g durante cinco minutos y recoja el sobrenadante.
Preparar perlas magnéticas sin etiqueta lavándolas tres veces con 500 microlitros de tampón de fosfato de citrato. Después del lavado final, retire el búfer y agregue el lysate de la célula a las cuentas. Gire la mezcla a 50 RPM durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Realice la separación magnética en el soporte magnético y recoja el lysate celular. Para unir las proteínas diana a las perlas conjugadas de inmunoglobulina, coloque las perlas en el soporte magnético durante cinco minutos. Deseche el búfer de citrato y agregue el lysate de celda a las cuentas.
Gire la mezcla durante una hora a 50 RPM. Para separar las proteínas diana de las proteínas libres no objetivo, lave las cuentas tres veces con 500 microlitros de tampón de fosfato de citrato que contienen 1%polisorbato 20. Después del lavado final, agregue 30 microlitros de tampón de citrato, y deje que las cuentas se sienten durante cinco minutos a temperatura ambiente para eluir las proteínas diana.
Para preparar la membrana, corte las membranas PVDF en piezas de 3 milímetros por 3 milímetros utilizando tijeras quirúrgicas que se limpiaron inmediatamente antes de su uso. Coloque las piezas de membrana sobre papel de aluminio y agregue dos a cinco microlitros de etanol a cada pieza. Antes de que las membranas estén completamente secas, agregue dos a cinco microlitros de la proteína eluyentes a cada pieza y séquelos al aire hasta que la superficie de la membrana se vuelva mate.
Luego transfiera las membranas a tubos de 1,5 mililitros y guárdelas a cuatro grados centígrados. Si se utiliza inmediatamente, añadir de dos a 30 microlitros de etanol que los hará hidrófilos. Retire el etanol con una pipeta, pero antes de que las membranas se sequen, agregue completamente 200 microlitros de solución de reacción a base de TDT a cada tubo, e incubarlos a 56 grados centígrados durante una hora.
Después de la incubación, sustituya la solución de reacción por 300 microlitros de solución de iodoacetamida e incubar en la oscuridad durante 45 minutos. A continuación, lave las membranas dos veces con agua destilada y una vez con 2% de acetonitrilo por vórtice durante al menos diez segundos. Trabajar con acetonitrilo diáfano puede ser extremadamente peligroso.
Siempre se debe usar una máscara, gafas y guantes al realizar el procedimiento de digestión en la membrana. Preparar la trippsina de acuerdo con las instrucciones del manuscrito, y añadir 100 microlitros de solución de reacción de trippsina a cada membrana. Incubar durante la noche a 37 grados centígrados para la digestión.
Al día siguiente, transfiera la solución de reacción a un tubo limpio de 1,5 mililitros y añada 100 microlitros de soluciones de lavado a la membrana. Incubar la membrana a 60 grados centígrados durante dos horas, luego recoger la solución de lavado y mezclarla con la solución de reacción. Añadir otros 100 microlitros de solución de lavado a la membrana y sonicar durante 10 minutos.
A continuación, recoja la solución de lavado y mezcle con la solución de reacción. Cubra el tubo de ensayo con una pieza de película de laboratorio y haga pequeños agujeros en la película con una aguja. Seque la solución con un concentrador de vacío y disuelva el residuo en 10 microlitros de ácido fórmico al 2%.
Centrifugar el tubo a 12.000 x g durante tres minutos y transfiera el sobrenadante a un tubo de muestra. Analice la muestra utilizando un espectrómetro de masas vinculado a un sistema nano LC/HPLC. Con este protocolo, se identificaron 17 proteínas en el inmunoprecipitante asociado Calpain-6, 15 en el inmunoprecipitante asociado a la GFP y 11 en ambos.
Es importante tener en cuenta que la detección de al menos un fragmento de péptido de alta fidelidad es necesaria para la identificación positiva de una proteína candidata. Las proteínas que se precipitaron en el lisolato que expresa la GFP, así como las histonas, las proteínas exógenas y ribosomales se omitieron de la lista. Lavar las membranas antes de la digestión tríptica con agua destilada y 2%acetonitrilo es el paso más importante en el procedimiento de digestión en membrana sobre las proteínas.
Siguiendo este método, es posible confirmar la co-precipitación de la proteína diana mediante la realización de otros experimentos, como la inmunoprecipitación y el análisis de manchas occidentales. Este sencillo método permite a los investigadores explorar las nuevas interacciones proteína-proteína con análisis convenientes y altamente sensibles.
