Este modelo murino de infracción miocárdica permite el seguimiento de los procesos patológicos que ocurren desde la oclusión coronaria hasta la insuficiencia cardíaca en etapa tardía en el tejido cardíaco local y los niveles sistémicos. Este método es compatible con cualquier lectura utilizada actualmente en biología cardíaca y fisiología. Además, se beneficia de la inmensa diversidad de modelos genéticos murinas.
La adquisición de habilidades quirúrgicas adecuadas puede tomar tiempo para dominar. Este procedimiento se aprende mejor paso a paso con un investigador experimentado. La demostración visual de este modelo murino permite compartir pistas que pueden ayudar con el procedimiento quirúrgico y acelerar el proceso de aprendizaje.
Usa una maquinilla de afeitar eléctrica para afeitar rápidamente un ratón anestesado de 25 a 30 gramos, macho, C57-Negro/6 en la garganta y el lado izquierdo de la caja torácica. Confirme la falta de respuesta al pellizco del dedo delfín. Aplicar pomada en los ojos del animal.
Coloque el ratón en la posición supina sobre una almohadilla de calentamiento y coloque una pequeña compresa debajo de la cabeza para evitar el sobrecalentamiento de los ojos. Asegure las extremidades con cinta adhesiva. Pase un lazo de sutura de seda 5-0 debajo de los incisivos superiores, y asegure la extremidad del lazo en la almohadilla calefactora para mantener la boca abierta durante la cannulación.
Aplica crema depilatoria en las zonas preafeitadas y masajea suavemente con un hisopo de algodón durante un minuto. Retire el exceso de piel y crema con gasa, y limpie la piel expuesta con gotas de 0.9%solución salina y gasa. Aplique trozos de gasa estéril en la garganta y el tórax afeitados, y remoje la gasa con yodopovida.
Ajuste el ventilador a un volumen de marea de siete mililitros por kilogramo y una tasa de ventilación de 140 golpes por minuto. Mueva el ratón bajo un microscopio estéreo de microcirugía. Sosteniendo la piel en el centro de la garganta, haga una incisión de 0,5 centímetros a lo largo de la línea caudal/cefálica, y separe los lóbulos de la glándula salival.
Utilice fórceps curvos para separar suavemente la fascia del músculo esternohoides hasta que la laringe y la tráquea sean visibles. A continuación, fije los bordes de la abertura con retractores unidos a bandas elásticas. A continuación, tire suavemente de la lengua hacia los lados, y utilice fórceps para insertar la aguja interna contundente de una cánula de calibre 16 en la tráquea.
Visualice una inserción correcta en la tráquea a través de la incisión de la garganta y conecte la cánula al respirador. Coloque estéril 0.9%saline suplementado con gasa empapada de yodopovida en la incisión para mantener los tejidos húmedos durante la operación. A continuación, coloque el tubo de escape en el agua.
La presencia de burbujas indica una intubación exitosa. Para la ligadura de la arteria coronaria descendente anterior izquierda, o LAD, mueva cuidadosamente el ratón a la posición de decúbito del lado derecho, y vuelva a resecacer la extremidad anterior izquierda en la nueva posición. Identifique la línea entre los músculos pectorales izquierdos y los músculos mayores, y haga una incisión oblicua de la piel de un centímetro a lo largo de la línea.
Usando micro tijeras diseccionantes contundentes, separe la fascia de los músculos pectorales sin incitar los tejidos, y utilice retractores unidos a bandas elásticas para mantener la separación. Ajuste el ventilador con una presión positiva de expiración final de tres centímetros de agua. Utilice fórceps contundentes para abrir la cavidad torácica en el tercer espacio intercostal entre la tercera y la cuarta costillas.
Coloque dos retractores en la caja torácica, uno en cada costilla, y use un fórceps fino curvado para eliminar cuidadosamente el pericardio sin dañar el corazón y los pulmones. Localice el LAD como una línea roja brillante superficial que va desde el borde de la aurícula izquierda hacia el ápice. Utilice un soporte de aguja para pasar una sutura de seda 7-0 debajo del LAD de dos a tres milímetros por debajo de las aurículas izquierdas.
Tirando de la seda lentamente para evitar desgarrar el tejido cardíaco, ate la ligadura con tres nudos. La parte inferior izquierda del ventrículo izquierdo se volverá pálida instantáneamente al ligadura. Ahora suelte los retractores de costillas, y sosteniendo la tercera costilla con fórceps, haga dos pasadas con una sutura de seda 6-0 debajo de la tercera y cuarta costillas.
Coloque tres gotas de solución salina de 37 grados Celsius 0.9% en la abertura, y cierre el tubo de escape de expiración durante dos o tres ciclos respiratorios para inflar correctamente los pulmones. Apriete y asegure la sutura con dos lanzamientos, y suelte los retractores que sostienen los músculos, ayudando a los músculos a volver a su ubicación anatómica correcta. A continuación, cierre la piel torácica con dos puntos de sutura y dos lanzamientos de seda de sutura 5-0.
Cierre la piel de la garganta con una puntada de seda de sutura 5-0 y dos tiros. Al final del procedimiento, retire las bandas de cinta de las extremidades, gire cuidadosamente el animal al decúbito ventral en la almohadilla de compresión y coloque una compresa en la almohadilla de calentamiento en el lado derecho del animal. Inyecte intraperitonealmente 0,3 mililitros de solución de glucosa calentada de 37 grados-Celsius 5%.
Detenga el respirador. Si el ratón respira espontáneamente, retire con precaución la cánula. Inyecte por vía subcutánea 0,1 miligramos por kilogramo de buprenorfina.
Coloque el ratón en una jaula de 30 grados Celsius ventilada con 100% de oxígeno durante al menos una hora con monitoreo. Durante los dos primeros días después de la cirugía, proporcione al ratón una dieta blanda y agua ad libitum, calentando al animal según sea necesario. Siete días después de la cirugía, las áreas isquémicas permanecen sin manchas por cloruro de triphenyltetrazolium, mientras que el tejido vivo se tiñe de rojo debido a la presencia de deshidrogenasas.
Las áreas isquémicas se pueden calcular como el porcentaje de área blanca del ventrículo izquierdo en un programa de software de imágenes. El análisis de manchas occidentales para la actina muscular alfa-suave y la fosforilación SMAD2, que son respectivamente lecturas importantes de miofibroblastos y de transformación de la activación de la señalización beta del factor de crecimiento, se puede utilizar para determinar el grado de fibrosis dentro del tejido miocárdico de los corazones infartos. También se puede realizar un análisis de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real de la transformación del factor de crecimiento beta y su expresión de ARNm objetivo posterior para evaluar la presencia de fibrosis miocárdica.
Las vías de señalización proinflamatoria y la expresión de genes proinflamatorios se encuentran típicamente para ser activados dentro de la primera semana después del infarto de miocardio. También se observa la expresión de ARNm de genes proinflamatorios y marcadores de monocitos/macrófagos. La altura de ligadura influirá críticamente en la supervivencia y debe adaptarse a cada cepa o genotipo, ya que la ramificación de LAD puede variar.
Las constantes en la ligadura son clave para obtener resultados reproducibles. Este procedimiento puede acoplarse con cualquier método analítico y puede ir seguido de análisis funcional, fijación de tejidos, cultivo celular o cualquier técnica de interés.
