Este protocolo permite el rastreo eficiente de linajes celulares e identidades en embriones vivos mientras analiza simultáneamente morfologías celulares detalladas como axones y dendritas en el desarrollo de neuronas C.elegans. En comparación con la microscopía confocal, la microscopía de iluminación selectiva de plano invertida de doble vista o diSPIM ofrece una mayor señal al ruido, una resolución espacial más isotrópica y es más adecuada para imágenes in vivo a largo plazo. Comience agregando 500 microlitros de 1%solución de metilcelulosa en la depresión de un portaobjetos cóncavo.
Usando un pico de alambre de platino, transfiera a los adultos de una placa media de crecimiento de nematodos a la solución de metilcelulosa M9. Utilice las puntas afiladas de las agujas hipodérmicas de calibre 18 para cortar cada animal transversalmente en el cuerpo medio a por lo menos uno a cuatro embriones celulares. Con una boquilla aspiradora sujeta suavemente entre los dientes, rellene previamente una pipeta microcapillar con 10 a 15 microlitros de tampón M9 y aspire suavemente varios embriones de la diapositiva en el capilar.
Dispensar los embriones en el rectángulo central del cubreobjetos de una cámara de imágenes de acero llena de tampón M9 fresco. Oriente suavemente los embriones verticalmente para que el eje largo de cada embrión sea perpendicular al eje largo del cubreobjetos. A continuación, coloque la cámara de imágenes de acero en el soporte de muestra en el escenario de un diSPIM.
Para preparar los embriones para la toma de imágenes, abra el microgerente y establezca las intensidades del láser en 179 microvatios 0,5% de equivalencia para 488 nanómetros y 79 microvatios 0,25% de equivalencia para 561 nanómetros. La calibración entre el ajuste del software y la salida láser verdadera debe realizarse con antelación para establecer el alcance de microvatios específicos. En el menú de plugins, seleccione el control del dispositivo y aplique imágenes científicas diSPIM para abrir la ventana de microscopía de iluminación selectiva de plano invertida de doble vista de imagen científica aplicada.
En la ficha Adquisición, confirme que los parámetros se establecen como se indica. En la pestaña de enfoque automático, establezca los parámetros como se indica. Tenga en cuenta que el canal de enfoque automático debe especificar el canal de fluorescencia nuclear para los experimentos de formación de línea planificados.
Marque las casillas de viga y hoja para la ruta A o B y haga clic en live para comenzar la adquisición de la imagen. Se abrirá una ventana de vista en vivo. A continuación, dibuje un cuadro alrededor del embrión de interés para seleccionar la región de análisis de enfoque automático del embrión y haga clic en Iniciar adquisición para iniciar la captura de imagen multidimensional a largo plazo.
Para la visualización de imágenes, el procesamiento y el análisis de linaje celular, después de descargar y extraer el paquete de software, haga doble clic en el archivo jnlp CytoSHOW_app. para comenzar a ejecutar CytoSHOW. En el menú de archivos, seleccione new y diSPIM monitor micro manager para localizar la carpeta del conjunto de datos raíz donde se guardaron las imágenes de micro manager sin procesar.
Seleccione cualquier carpeta de punto de tiempo y haga clic en Abrir. Las ventanas de navegación multidimensionales se abrirán automáticamente para SPIM A y SPIM B.Utilizando la herramienta de selección de polígonos, haga clic justo fuera de los bordes anterior, posterior, dorsal y ventral del embrión de interés para generar un patrón de lazo sobre el embrión en las vistas SPIM A y SPIM B y haga clic en diSPIM. Alinee los canales verdes y rojos para cada brazo SPIM y haga clic de nuevo en diSPIM.
Los cambios se activarán en todas las demás ventanas de posición. A continuación, haga clic en diSPIM y fusionar para abrir el cuadro de diálogo de volúmenes de datos sin procesar de fusible diSPIM desconvolucionado y establezca los parámetros como se indica. Cuando se hayan establecido todos los parámetros, haga clic en Sí y especifique el directorio de salida en el que desea guardar los archivos procesados antes de hacer clic en Aceptar. En la ventana de vista previa, mueva la barra de desplazamiento t al punto de tiempo dos de la ventana y mueva el deslizador z hasta que se muestre la vista directamente a lo largo del eje largo del embrión.
Mueva la barra de desplazamiento t de nuevo al punto de tiempo uno en la ventana de vista previa y utilice la herramienta de selección de líneas para dibujar una línea desde el núcleo más redondo ventral a través del plano de las placas metafase de celda AB. Haga clic en el botón de vista previa diSPIM para guardar los ajustes finos en la orientación del volumen de imagen previsualizada. Establezca las barras de desplazamiento t de las ventanas del monitor diSPIM en los puntos de tiempo inicial y final del intervalo completo de imágenes que se van a procesar.
A continuación, haga clic en Aceptar. Para un análisis de linaje celular eficiente y preciso, es fundamental lograr una orientación ADL precisa de los volúmenes de datos antes del procesamiento de La Noche Estrella. Para abrir la serie de seguimiento de linajes Starry Night en AceTree, abra el archivo AceTree personalizado proporcionado y seleccione Abrir archivo de configuración para localizar el directorio de salida indicado anteriormente. Abra la subcarpeta de fusible para el embrión de interés y seleccione el archivo editado.
A continuación, haga clic en Abrir y continúe con la visualización y edición del linaje como se describió anteriormente. Los protocolos optimizados no inducen ninguna fototoxicidad detectable a los embriones, tal como se evalúa en el momento de la eclosión y el momento relacionado con los hitos del desarrollo. Usando este protocolo como se demostró, las células no identificadas en esta proteína fluorescente verde transgénica que expresa la cepa de nematodo se determinó que corresponden a las neuronas motoras, la célula excretor del canal, y dos células musculares.
Las neuronas identificadas fueron oblicuamente moldeadas tan pronto como 360 minutos después de la fertilización con el eje celular más largo que representa el eje subsiguiente para el crecimiento de la neurita. De 385 a 410 minutos después de la fertilización, las neuritas rmDD extendieron aproximadamente seis micrómetros antes de los cuerpos celulares. De 415 a 445 minutos después de la fertilización, ambas neuritas se extendieron dorsalmente dentro y alrededor del anillo nervioso presuntivo.
En promedio, cada neurita RMDD extendió aproximadamente 11 micrómetros del cuerpo celular antes de cumplir sincrónicamente con su contraparte contralateral en el ápice del anillo. En conjunto, estos datos demuestran que las características neuronales de desarrollo para células identificables individuales pueden ser examinadas, comparadas y cuantificadas usando este protocolo integrado. Es importante recordar orientar los embriones verticalmente para que el eje largo de cada embrión sea perpendicular al eje largo del cubreobjetos.
Usando este protocolo, hemos comenzado a explorar el naciente sistema nervioso embrionario desde todos los ángulos. Por ejemplo, durante el parto celular, la migración y diferenciación, la formación de neuritas, el crecimiento y la fasciculación.
