Los virus entéricos se encuentran principalmente en diferentes embalses acuáticos, incluyendo aguas subterráneas, aguas quietas, arroyos, ríos y agua r. Están asociados con riesgos para la salud y son responsables de las infecciones en los seres humanos. Los virus entéricos suelen causar gastroenteritis y se transmiten principalmente por la vía fecal-oral.
Otras enfermedades transmitidas por el agua causan hepatitis aguda por el virus de la hepatitis A y los virus de la hepatitis E, con una mortalidad asociada significativa, especialmente con respecto a la hepatitis E en mujeres embarazadas. Los protocolos reales para el seguimiento de la calidad del agua propuestos para contextos humanitarios han sido diseñados para mantener bacterias como E. coli como un indicador de contaminación fecal. Pero ya se sabe que no hay correlación con otros microorganismos como los virus que son más resistentes a muchos procesos de activación.
Hasta ahora, la detección de virus en entornos humanitarios de crisis se ha realizado adaptando los protocolos existentes a las condiciones de esos contextos y enviando muestras a laboratorios de referencia para la detección molecular de virus. Es necesario establecer métodos para detectar patógenos virales e indicadores virales en el punto de vista para reducir los riesgos para la salud pública, prevenir brotes y aumentar la eficiencia de las intervenciones humanitarias. Proponemos un método para la detección de virus en muestras de agua de 10 litros que se divide en tres pasos: Concentración viral, extracción de ácido nucleico y detección viral.
Todos estos pasos han sido adaptados a partir de los métodos actualmente en uso en nuestro laboratorio, y se pueden realizar en el punto de vista mediante el uso de reactivos y equipos portátiles, produciendo los dependientes de la fuente de alimentación y congeladores. Además, se ha añadido una solución conservante al método para garantizar la estabilidad de los ácidos nucleicos para su envío a laboratorios de referencia si es necesario. El método que proponemos se llama VirWaTest y ha sido desarrollado con la colaboración de GenIUL e Intermon Oxfam.
Antes de empezar, se debe tener en cuenta el número de muestras a analizar para la preparación de reactivos y material. Se recomienda recoger dos réplicas de cada muestra de agua para obtener resultados representativos. Se pueden probar varias muestras al mismo tiempo si se dispone de la cantidad adecuada de material.
Los reactivos y materiales deben prepararse y embalarse antes de moverse o enviarse al lugar donde se necesita el método. La lista de materiales y equipos pequeños que deben embalarse se describe en la tabla uno. Preparar un stock bacteriófago MS2 que se añadirá a cada muestra de agua como control del proceso siguiendo el método ISO correspondiente.
A continuación, distribuya 10 microlitros de una suspensión que contenga de 10 a 10 unidades de plataforma pre-fabricadas en tubos de 10 ml y deje que el agua se seque. Se necesitará un tubo por muestra de agua. Además, prepare un tubo que contenga 10 ml de agua destilada estéril por muestra recolectada.
Para la solución de leche desnatada pre floculada, prepare un tubo que contenga la leche desnatada, una bolsa de plástico con cremallera que contenga la sal marina y una botella de plástico que contenga el agua destilada. Para el ajuste del pH, prepare un tubo que contenga el ácido cítrico, un tubo que contenga el hidróxido de sodio y dos recipientes de plástico con 25 y 50 ml de agua destilada. Para cada muestra de agua a probar, preparar un sobre acondicionador añadiendo las sales marinas y el ácido cítrico a una bolsa de plástico de cremallera, y una solución de conservación mediante la adición del tampón de lisis, y conservante de ácido nucleico, a un tubo de 5 ml.
Por último, prepare cuatro sobres neutralizantes, añadiendo detergente de potencia a cuatro bolsas de plástico con cremallera. Para cada muestra de agua que se extraiga, prepare un tubo de cinco ml que contenga partículas magnéticas y etanol, y tres tubos de 2 ml que contengan 500, 600 y 200 microlitros de tampones de lavado uno, dos y tres, respectivamente, y un tubo que contenga tamampón de elución. Se pueden analizar simultáneamente dos extracciones diferentes de ácido nucleico en cada ensayo de PCR si se utiliza un termociclador Newell.
Para todos los ensayos de PCR, preparar el agua de biología molecular. Preparar mezclas que contengan dos imprimaciones y una prueba específica para cada virus objetivo de acuerdo con los volúmenes y concentraciones descritos en el protocolo. Para cada virus, agregue los volúmenes indicados en los tubos de uno a ocho de una bandeja de tubos.
Corta la tira, dividiéndola en dos tiras. Tubos uno a cinco y tubos de seis a ocho. Para cada virus, suspensión de ADN seco al aire que contienen de 10 a 5, 10 a 7 y 10 a 9 y copias conocidas hechas previamente en tubos seis, siete y ocho.
Este protocolo de concentración se basa en el principio de floculación orgánica por el cual el pH bajo y la condición de alta conductividad impulsan las proteínas de leche descremadas para organizar en flocs a los que absorben los virus. Una vez que los flocs están resueltos, se pueden recoger fácilmente. Recoger una muestra de agua de 10 litros en un cubo de fondo plano provisto con una tapa.
Si se recoge de una tubería, deje que el agua corra durante unos segundos antes de recoger el agua. Es importante utilizar cubos transparentes para visualizar pellets. Busque un espacio plano en un lugar fresco lejos de la luz solar directa Coloque un agitador magnético conectado a una batería debajo del soporte del cucharón y coloque el cubo que contiene la muestra de agua en cada soporte.
Reconsidere el ácido cítrico y el hidróxido de sodio y agite hasta que se disuelvan por completo. Vierta 500 ml de agua destilada en una bolsa de pie y coloque la bolsa en un agitador magnético. Agregue el contenido de un sobre de sal marina y el contenido de un tubo de leche descreado y revuelva durante cinco minutos a velocidad media.
Ajuste el pH de la leche desnatada floculada utilizando ácido cítrico e hidróxido de sodio a un pH entre 3,4 y 3,6. Apague el agitador magnético y asegúrese de que los flocs estén visibles. Una linterna puede ayudar a visualizar los flocs.
Suelte un imán de agitación en el agua. Ajuste el agitador magnético a la máxima velocidad y enciéndalo. Añadir 10 ml de agua destilada a un tubo controlado por proceso.
Invertir un par de veces y verter la solución en el agua. Vierta el contenido de un sobre de acondicionamiento de muestra en el agua y revuelva durante cinco minutos. Asegúrese de que el pH de la muestra de agua, que debe estar entre 3,4 y 3,6.
Ajuste el pH si es necesario. Añadir 100 ml de solución de leche desnatada pre-floculada, sellar el cubo con la tapa y dejar el agua revolviendo durante ocho horas a una velocidad mínima. Después de ocho horas, apague el agitador magnético y deje que los flocs se conformen durante al menos cinco horas adicionales.
Con un sistema basado en el uso de un controlador de pipetas, un tubo de plástico y un par de pipetas, deseche el sobrenadante, teniendo cuidado de no molestar a los flocs en el fondo del cucharón. Cuando el nivel de agua esté a punto de llegar al imán de agitación, apriete el tubo de plástico para detener el flujo de agua y aleje la pipeta del cubo. Agitar el cubo para resuspender los flocs y verterlos en una bolsa de plástico de pie.
Permita que los flocs se conformen durante una hora extra. Aspirar cuidadosamente el sobrenadante de agua usando una pipeta evitando molestar a los flocs. Aspirar los flocs con una pipeta y transferirlos a un tubo cónico.
Anote el volumen final del concentrado de muestra y transfiera 1 ml a un tubo que contenga la solución conservante. La suspensión se puede utilizar para realizar la extracción de ácido nucleico en el campo, o enviar a un laboratorio de referencia para su posterior análisis. El agua desechada durante la recogida de los flocs debe tratarse antes de su eliminación.
Agregue el contenido de un sobre de agente neutralizante al cucharón que contiene el agua desechada. Mezcle el agua y déjela quieta durante treinta minutos. A continuación, deseche el agua tratada como residuo general.
Las partículas magnéticas se pueden transferir de un tubo a otro utilizando una pipeta magnética. Acostumbrarse al funcionamiento de una pipeta magnética antes de realizar la extracción. Coloque los tubos que contienen el reactivo necesario para la extracción en un bastidor.
Es decir, de izquierda a derecha: búfer de enlace, búferes de lavado y búfer de elución. Transfiera 1 ml de concentrado de muestra al tubo que contiene el tampón de unión utilizando una pipeta de plástico desechable. Invierta el tubo diez veces para optimizar la solución.
Incubar la solución a temperatura ambiente durante diez minutos mientras se mezcla continuamente utilizando un orbital solo o manualmente. Recoger las partículas magnéticas utilizando una pipeta magnética y una punta limpia que se puede reutilizar para los tres tampones de lavado y liberar las partículas magnéticas en el tubo que contiene el búfer de lavado uno. Lávelos agitando suavemente la solución con la punta durante treinta segundos y recógelos.
Repita este procedimiento de lavado para lavar los tampones dos y tres. Recoger las partículas magnéticas en el tampón de lavado tres y liberarlos en el tubo que contiene el tampón de elución. A continuación, deseche la punta.
Incubar la solución a temperatura ambiente durante cinco minutos mientras se mezcla continuamente utilizando el orbital en solitario. Sustituya la punta de la pipeta magnética por cualquiera y recoja todas las partículas magnéticas del búfer de elución. Deseche la punta con las partículas conectadas.
El ácido nucleico permanece en el tampón de elución, que debe almacenarse para su posterior análisis o envío. Use una tira de cinco tubos y una tira de tres tubos preparada para detectar adenovirus humanos. Agregue agua, mezcla de PCR y extracción de ácido nucleico a los tubos uno a cinco de acuerdo con el protocolo.
Después, agregue agua y PCR a los tubos de seis a ocho. Coloque ambas tiras en el termociclador y seleccione la carrera adecuada. Una vez finalizada la ejecución, recopile los resultados y analice los datos obtenidos.
Sólo cuando las pruebas virales han dado lugar a negativo, se debe realizar la detección de MS2. Utilice tiras de tubo preparadas para la detección de MS2 y seleccione el perfil térmico adecuado para la PCR. La extracción de ácido nucleico magnético VirWaTest se comparó con el ARN viral QIAgen, lo im imitaba probando muestras de agua espigadas con adenovirus humanos y MS2.
El valor p de la prueba de reducción muestra recuperaciones virales significativamente más altas mediante el uso de VirWaTest que QiAgen como método de extracción para ambos virus probados. El método desarrollado para la concentración viral se probó en el campo con la colaboración de los equipos de lavado de Oxfam ubicados en Bangui, República Centroafricana y en Pedernales, Ecuador, que recogieron muestras de agua, las concentraron aplicando el método de concentración desarrollado, y las enviaron al laboratorio de Barcelona para la extracción de ácido nucleico y la cuantificación viral. En Ecuador, se detectaron adenovirus humanos en todas las muestras analizadas, mientras que una de cada cinco muestras recogidas y concentradas en Bangui dieron positivo para los adenovirus humanos.
El método desarrollado ha demostrado ser útil cuando fue evaluado por los equipos de lavado de Oxfam Intermon en Bangui, República Centroafricana y por otro equipo en Pedernales, Ecuador. VirWaTest puede ser parte de un sistema de alerta temprana o puede ser utilizado en la investigación de brotes por organizaciones involucradas en el saneamiento del agua. Este equipo facilita el análisis de patógenos virales en el agua y la mejora de la gestión de la seguridad del agua con el objetivo de reducir los incidentes de enfermedades virales en contextos humanitarios de crisis.
