El uso de un modelo para desarrollar un modelo de masa de cáncer hepatocelular podría ayudar a las personas a dilucidar su inmunotolerencia inducida por tumores y a la inmunosuencia de tumores específicos. El tumor ortotópico que se desarrolla con la técnica de fibrosis hepática imita las características clínicas del cáncer de hígado humano. Este método podría proporcionar una herramienta útil en el estudio inmunológico del cáncer hepatocelular.
La demostración visual de este método puede ilustrar los pasos más difíciles técnicamente, como la inyección intraesplénica, que son esenciales para una ejecución exitosa de este protocolo. A continuación, sujeta manualmente a un macho, de seis a ocho semanas de edad de edad 6 ratón de lado dorsal hacia arriba. Utilice exfoliantes alternativos de 70% de etanol y Betadina para limpiar el lugar de inyección tres veces.
A continuación, entregue 160 microlitros de tetracloruro de carbono al ratón mediante inyección intraperitoneal y devuelva al animal a su jaula de origen. Después de confirmar la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie, en un ratón transgénico de antígeno simiano de cinco meses de edad, coloque el ratón en la posición supina y asegure las extremidades con cinta adhesiva. Hacer una incisión de laparotomía de línea media a lo largo de la longitud de la linea alba, lo suficientemente grande como para proporcionar una exposición adecuada del hígado, y desplazar los intestinos hacia la izquierda.
Disecciona sobre el hígado para exponer la vena cava inferior. Inducir una abrazadera de arteria para ligar el vaso. Utilice una aguja de mariposa para obtener acceso intravenoso a la vena porta y asegurar manualmente el catéter.
Cambiando cuidadosamente las jeringas para cada solución, entregando con éxito 15 mililitros de solución uno, 15 mililitros de 0.75%solución de colagenasa dos, y 15 mililitros de solución dos sin colagenasa a través del catéter, a un aproximado de 8,9 mililitros de solución por minuto de flujo. Al final de la perfusión, cosecha la masa tumoral en un tubo cónico de 50 mililitros que contiene de 10 a 15 mililitros de PBS. Excóstate del tumor del próximo ratón MTD2 como se acaba de demostrar.
Usa tijeras para cortar los hígados en trozos más pequeños. Transfiera los tejidos a un nuevo recipiente de PBS fresco para extraer el resto de la sangre del tejido antes de transferir las piezas de tejido a un tubo cónico de 50 mililitros que contenga cinco mililitros de medio RPMI completo. Mince las muestras de hígado lavado hasta que las piezas pueden caber fácilmente a través de la punta de una pipeta de cinco mililitros.
Añadir suficiente medio al tubo para alcanzar un volumen final de 30 mililitros. Utilice una pipeta de cinco mililitros para triturar los fragmentos de tejido, antes de filtrar la solución a través de un colador de 70 micrómetros en un nuevo tubo de 50 mililitros. Lavar el colador varias veces con un medio completo.
Ajuste el volumen final a 50 mililitros con un medio completo adicional. Gire rápidamente la suspensión por centrifugación hasta un máximo de 50 veces g antes de detener la centrífuga y decantar el sobrenadante. A continuación, resuspender el pellet en 20 mililitros de PBS para el conteo.
Para la inyección intraesplej de los hepatocitos MTD2, cargue una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 27 por cada animal receptor con 220 microlitros de hepatocitos por ratón. Confirme la falta de respuesta a la pellizca del dedo del pie en un animal anestesiado tratado con tetracloruro de carbono. Comenzando justo debajo del músculo de la columna vertebral, a continuación, hacer una incisión de un centímetro en el flanco izquierdo paralelo a la costilla decimotercera del extremo dorsal y utilizar fórceps de punta roma para exteriorizar el bazo.
Sujeta el bazo con dos clips de titanio de tamaño medio entre la arteria esplénica y la vena, y entrega 200 microlitros de células en el polo inferior del bazo. Recorte la rama inferior del pediculo con un clip de tamaño medio y corte el bazo entre los dos clips colocados inicialmente. Retire el polo inferior del bazo que se inyectó directamente con las células tumorales y utilice 3-0 poliglactin 910 sutura interrumpido para cerrar la capa muscular interna.
A continuación, utilice clips de herida de acero esterilizado para cerrar la capa externa de la piel y administrar por vía subcutánea cinco miligramos por kilogramo de carprofeno. Después del aislamiento de ratones transgénicos de antígeno T como se ha demostrado, se pueden observar hepatocitos y células infiltrantes tumorales. Las células suelen demostrar una viabilidad de casi el 100% después del procesamiento.
Después de la inoculación intrasplénica en animales tratados con tetracloruro de carbono de tipo salvaje, los hepatocitos trasplantados crecen con éxito y de forma fiable tumores de carcinoma hepatocelular ortotópicos que expresan el antígeno simiano específico del tumor 40 T. La preparación de nuestra población viable y pura de hepatocitos a partir de la masa MTD2 y la administración precisa de la inyección intraesplénica son importantes para el éxito del procedimiento. Aunque nuestro equipo ha probado la inoculación de hepatocitos en ratones receptores a través de la inyección intravascular e intraperitoneal, estos otros métodos no fueron capaces de inducir carcinoma hepatocelular ortotópico.
Este modelo proporciona una plataforma única que permite la investigación de la vigilancia inmune y la tolerancia en sus etapas tempranas y posteriores de la progresión tumoral. Tenga cuidado al usar el tetracloruro de carbono, ya que es tóxico.
