Un repunte de las epidemias recientes, como el virus del Zika y el virus del Ebola, ha puesto de relieve la necesidad de una respuesta más coordinada y ágil a escala mundial. Para lograrlo, hemos diseñado una unidad de laboratorio innovadora, escalable e intramodales que se utilizará en áreas con recursos limitados en todo el mundo durante dichos brotes. Aquí presentamos nuestros laboratorios de contenedores de envío móvil intramodales, ampliables.
Y en el siguiente documento, presentamos nuestro enfoque BSL-2 y BSL-3 para el diagnóstico del virus de la gripe respiratoria. Diagnóstico rápido del virus de la gripe por RCT-PCR. Antes de prepararse para entrar en la unidad de laboratorio instalada, tenga en cuenta que todos los requisitos de seguridad de BSL-2 deben tenerse en cuenta.
Esto incluye vestirse con el equipo de protección personal adecuado, lavarse las manos, usar guantes y descontaminar cualquier espacio de trabajo que planee usar. Tenga en cuenta que, si utiliza lejía para descontaminar su espacio de trabajo y suministros, también debe usar 70%etanol para limpiar todas las áreas expuestas a la lejía, ya que la lejía puede mezclarse con otros productos químicos en el espacio de trabajo para crear humos tóxicos. Deseche todos los productos de lejía en su propia papelera designada.
A medida que se toman hisopos de muestra de los pacientes, se transportan a las instalaciones del laboratorio desde el campo o la clínica y se pasan al técnico de laboratorio a través de la ventana de paso. Esta ventana no se puede abrir desde ambos lados. En la ventana de paso BSL-2, la superficie externa de los tubos que contienen muestras debe desinfectarse completamente con lejía y dejarse sola para que se siente durante dos minutos.
Abra la ventana de paso a través y recoja los ejemplos que se van a registrar. Limpie las muestras que tengan restos de lejía y limpie el interior de la ventana de paso con lejía, seguido de una solución de etanol al 70%. Agregue códigos de barras a cada tubo de muestra y sus cuatro tubos vacíos designados para las alícuotas.
Mueva sus muestras a la campana de ventilación. Escanee el código de barras en cada tubo y asegúrese de que la información de identificación de muestra adecuada aparezca en el sistema basado en tabletas o en la pantalla del portátil. Complete el proceso de registro.
Muestra alícuota. Una vez etiquetados los tubos de ensayo, utilice un gabinete de bioseguridad de clase II certificado y descontaminado para tomar alícuotas de muestras. Al tomar alícuotas, asegúrese de utilizar pipetas estériles o desechables frescas para cada muestra y desechelas en contenedores de residuos biopeligrosos para evitar la contaminación cruzada.
Asegúrese de que todos los tubos estén herméticamente sellados y cerrados. Utilice una alícuota por espécimen para la extracción inmediata. Almacene cualquier otra alícuota en el congelador para su uso futuro.
Antes de pasar a la estación de trabajo, limpie todas las superficies y equipos del espacio de trabajo con lejía seguido de una solución de etanol al 70%. Una vez que sus muestras de PCR con código de barras hayan sido alícuotas, muévalas a una estación de trabajo designada para su extracción. Prepare la mezcla de ARN portadorA AVL del tampón para el paso de la lelisis.
La mezcla maestra del tampón de muestra y de la lesis debe mantenerse a temperatura ambiente. Etiquetar un tubo centrífugo de 1,5 mililitros. Ajuste la punta de la pipeta a 560 microlitros.
Aplique una punta de pipeta limpia. Agregue un búfer de lysis a cada tubo. Deseche la punta en el contenedor de residuos.
A continuación, tome su muestra de alícuota de PCR. Colóquelo en el tubo tampón de lelisis preparado designado para aliquot uno, y repita esto para cualquier muestra adicional. Deseche la punta de pipeta vieja y aplique una punta de pipeta limpia.
Aplique una punta de pipeta limpia. Agregue 140 microlitros de un tampón al tubo de control. Cierre cada tubo de forma segura.
Pulso-vórtice durante 15 segundos. Repita con cualquier alícuota o muestra adicional. Microcentrífuga cada muestra durante cinco segundos.
Incubar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de 10 minutos centrifugar brevemente los tubos para retirar cualquier gota del interior de la tapa de cada tubo. Añadir 560 microlitros de etanol el de la muestra.
Cambia la punta de la pipeta. Repita con cualquier muestra restante o adicional. Cierre cada tubo de muestra de forma segura.
Pulso-vórtice cada muestra durante 15 segundos. Microcentrífuir las muestras durante cinco segundos. Obtenga un tubo de recogida limpio de dos mililitros.
Agregue las columnas de giro. Etiquétalos para que coincidan con tus muestras. Transfiera 630 microlitros de la muestra para que coincidan con la columna en consecuencia.
Aseguren sus gorras. Muévete a la centrífuga. Distribuya uniformemente sus muestras en la centrífuga.
Centrifugar a 6000 g durante un minuto para eliminar el búfer de lelisis. Vuelva a la estación de trabajo. Sustituya los tubos de recogida.
Agregue el búfer de lelisis restante y repita el paso de centrifugación. Deseche los tubos de muestra alícuota originales, después de lo cual, deseche el eluido y lave la columna de centrifugado con el tampón AW1. Repita este procedimiento con cada muestra o cualquier muestra adicional.
Asegure las tapas de cada muestra y centrífuga a seis g. Repita con el segundo tampón de lavado AW2 a 20 g. Por último, coloque la columna en un tubo limpio de 1,5 mililitros.
Abra la columna y añada 60 microlitros de TAMPón AVE. Incubar a temperatura ambiente durante un minuto y centrifugar a seis g durante un minuto. La muestra ya está lista para el análisis de PCR.
Bajo las condiciones BSL-3 el protocolo experimental seguirá siendo el mismo, pero las medidas de seguridad tendrán precedentes por encima de cualquier otra cosa. Antes de entrar en el laboratorio BSL-3, mire a través de la ventana transparente para asegurarse de que se ha establecido presión negativa en la unidad de guantera. Será evidente que se ha establecido una presión negativa cuando la bola en la pared es visible.
Una vez establecida la presión negativa, abra la puerta y entre en la unidad. Lávese inmediatamente las manos y luego proceda a su lista de verificación de EPI. Proceda a ponerse el EPP en el siguiente orden: debajo de guantes, bata, fundas de zapatos, máscara, protector facial, segundo par de guantes.
Encienda la máquina y deje que la presión de la guantera se estabilice. Utilice una solución de rociado de lejía para descontaminar todas las áreas y suministros que planea usar dentro y fuera de la guantera. Deseche cualquier producto de desecho de lejía en un recipiente solo para lejía.
Utilice una solución de 70% de etanol para limpiar sobre cualquier área donde se haya utilizado lejía. Transfiera sus muestras a través de la ventana de paso a través. Las muestras deben haber sido rociadas con solución de lejía y dejarlas solas durante al menos un minuto en el paso antes de recibirlas dentro de la unidad BSL-3.
A continuación, reciba sus muestras dentro de la unidad BSL-3 y límpielos a fondo antes de continuar con el paso de registro y etiquetado. Una vez que las muestras estén registradas y los tubos hayan sido etiquetados, coloque las muestras en la guantera a través de la bandeja de la esclusa. No abra ambas puertas a la vez.
Abra y cierre cada puerta en dos pasos diferentes para las precauciones de seguridad. Una vez que las muestras se hayan movido de forma segura al interior de la guantera, siga los mismos pasos descritos anteriormente para crear alícuotas de muestra en la guantera. Una vez que las muestras estén alíotas, mueva las muestras al recipiente hermético.
Rocíe la solución de lejía dentro de la guantera para descontaminar los tubos y todas las demás superficies. Espere cinco minutos y luego aplique una solución de 70% de etanol para lavar la lejía. Después de la descontaminación completa mover sólo las muestras necesarias para el análisis de PCR para la lysis volver a la guantera.
En la guantera realice sólo el paso de lysis del procedimiento de extracción. Una vez que las células han sido lanizadas, selle firmemente las tapas de cada muestra y colóquelas en el pasaje de la esclusa presurizada. Descontamine la guantera de nuevo con lejía seguida de una solución de etanol al 70%.
Saque las muestras de la guantera y transfiéralas a la estación de trabajo para los pasos restantes del procedimiento de extracción. Después de la extracción, transfiera sus muestras a la ventana de paso a través para el análisis de PCR. Después de que las muestras hayan sido retiradas y transferidas, descontamine el espacio de trabajo del laboratorio fuera de la guantera.
Antes de retirar el EPP, espere hasta que la circulación de aire en la unidad haya alcanzado de forma segura un número adecuado de ciclos de filtrado antes de comenzar a extraer el EPP. Inmediatamente después de retirar y desechar todo el EPP en el contenedor de residuos de EPI, proceda a lavarse las manos en el fregadero del laboratorio con agua y jabón antes de salir de la unidad. Amplificación y detección de PCR.
Retire las muestras de ARN extraídas de la ventana de paso a través. Prepare una mezcla maestra en un tubo de 1,5 mililitros con los siguientes componentes para cada ensayo dirigido: agua, imprimaciones y sondas, mezcla de ataque y tampón 2X. Vórtice y girar su mezcla maestra, después de lo cual, aliquot la mezcla maestra en cada uno de los tubos de tira.
Vuelva a colocar el kit de PCR en el almacenamiento a las temperaturas recomendadas una vez preparada la mezcla maestra. Agregue las muestras a cada uno de los tubos de tira utilizando una punta separada entre cada tubo de tira. Gire las muestras a 1.500 rpm durante un minuto, después de lo cual las muestras están listas para ser cargadas en la unidad de PCR en tiempo real.
Una vez que las muestras se cargan en el instrumento PCR, se tarda aproximadamente 90 minutos en completar una ejecución. El ensayo de PCR en tiempo real es un método sensible para la detección robusta del virus. Esto se puede ver en la tabla etiquetada: Resultados analizados PCR.
Antes de recoger los resultados y salir del laboratorio, retire el EPP y descontamine adecuadamente cada estación de trabajo como preparación para la siguiente prueba de diagnóstico. Resultados representativos. El flujo de trabajo de laboratorio se representa en el diagrama que hace hincapié en la protección personal.
La prueba de diagnóstico rápido de la gripe se realiza mediante el análisis RT-PCR. El procedimiento consta de cuatro pasos principales y se asignan espacios de trabajo individuales para cada etapa del protocolo. El objetivo de este proyecto es validar una nueva instalación modular de laboratorio de despliegue rápido y lo hemos hecho con éxito, así como desarrollar programas de capacitación para el personal de laboratorio que trabaja en entornos de bajos recursos durante epidemias y brotes.
