Sin protocolo, es posible investigar el proceso dinámico de diferenciación de mioblast y formación de miofibra, en particular el posicionamiento nuclear mediante la explotación de imágenes de células vivas. Las imágenes celulares vivas de mioblast con núcleos celulares extraños permiten el estudio de la diferenciación de mioblast en células vivas y el seguimiento automático de los núcleos. La demostración visual ayuda a comprender cómo combinar el aislamiento de células primarias con imágenes en vivo y análisis de imágenes.
Demostrando el procedimiento con Frederica Colombo, estará Giorga Careccia, estudiante de doctorado en nuestro laboratorio. Comience por cosechar el soleus tibialis, extensor digitorum longus, gastrocnemius, cuádriceps y músculos tríceps de ambas extremidades posteriores de un ratón adulto en un plato Petri de PBS en hielo. Usa tijeras y pinzas estériles para eliminar cuidadosamente los tendones y la grasa de cada músculo y transferir los músculos a una placa Petri vacía.
Usando tijeras curvas estériles cortadas y picando los músculos hasta obtener una masa uniforme y transferir las piezas musculares a un tubo de 50 mililitros. Luego agregue 10 mililitros de medio de digestión a las piezas musculares para una incubación de 30 minutos en un baño de agua de 37 grados centígrados a 250 rotaciones por minuto. Al final de la digestión enzimática, detenga la reacción con 10 mililitros de medio de bloqueo.
Y gira la muestra por centrifugación. Coloque el tubo sobre hielo y transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 50 mililitros. Centrifugar el sobrenadante otra vez.
Y re-suspende el pellet en un milímetro de DMEM. Suplementarlo con un diez por ciento de suero bovino fetal, o FBS, sobre hielo. Digerir el pellet reservado en 10 mililitros de medio de digestión fresca como acaba de demostrar y combinar el pellet digerido con la suspensión de la célula de reserva, sobre hielo.
Tensar las células extraídas a través de un filtro de 70 micrómetros, seguido de un filtro de 40 micrómetros. Y lavar las células en 15 milímetros de DMEM fresco, complementado con 10 por ciento DE FBS. Al final de la centrifugación, vuelva a suspender el pellet en tres mililitros de tónifica de glóbulos rojos a temperatura ambiente.
Detener la lelisis después de cinco minutos con 40 mililitros de PBS y una centrifugación adicional. Re-suspender el pellet en 20 mililitros de DMEM complementados con 10 por ciento FBS y pre-placa las células en plato Petri sin recubrimiento. Después de una hora a 37 grados centígrados y el cinco por ciento de dióxido de carbono recogen la célula del satélite que contiene sobrenadante.
Y pre-placa la suspensión celular dos veces más como se demostró. Después del último chapado, recoger las células del satélite por centrifugación y volver a suspender el pellet en 40 mililitros de medio de proliferación fresca. Dividir las células entre dos colágeno recubiertos 150 mililitros Petri platos con un microgramo por mililitro de doxiciclina por plato para inducir la expresión H2BGFP.
Y devuelva las células a la incubadora de cultivo celular durante dos o tres días. Cuando los mioblastos hayan alcanzado la densidad experimental adecuada, lave las células en cada plato con cinco mililitros de PBS y separe las células de los fondos de la placa con dos mililitros de Tripppsin por plato a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Confirme el desprendimiento por microscopía ligera y detenga la reacción con cinco mililitros de DMEM más un diez por ciento de FBS por placa.
Para la imagen de células vivas, placa dos veces diez a la quinta célula en cada pozo de una placa de 12 pozos recubierto con 350 microlitros de medio de diferenciación, complementado con matriz de membrana sótano por pozo durante dos horas. Cuando las células se hayan adherido a la parte inferior de la placa, coloque la placa en una incubadora de dióxido de carbono de 37 grados y cinco por ciento en una etapa de microscopio confocal y utilice un objetivo 20 veces seco para obtener campos de visión con cientos de células para adquirir imágenes de 16 bits con 1024 por 1024 píxeles por fotograma cada seis minutos durante 16 horas. Para cada posición adquirida, genere un archivo tif de punto de varias tramas y descargue y extraiga el software de cremallera de puntos proporcionado en una carpeta seleccionada.
Abra el ejemplo de la carpeta de seguimiento de segmentación y haga clic en hacer el punto de segmentación M para abrir la ventana de comandos en Matlab. Cambie los scripts de punto M de la segmentación debida para que la pista de nombre de archivo variable sea el nombre del archivo tif y la pista de entrada de ruta de acceso sea la carpeta donde está contenido el tif de punto. Haga clic en Ejecutar para ejecutar el script.
El resultado de la segmentación se guardará como una estera de puntos de archivo, mientras que la segmentación de los núcleos se puede visualizar en la figura de salida. Para generar las pistas, primero haga doble clic en generar pistas punto M en la misma carpeta de trabajo. A continuación, cambie el nombre de archivo para que el nombre de archivo apunte el archivo de tapete de punto adecuado para los núcleos segmentados.
Haga clic en Ejecutar para ejecutar el script. El resultado del seguimiento se guardará como otro archivo de alfombra de puntos y las pistas generadas se trazarán. Evaluar la calidad de las pistas.
En primer lugar, haga doble clic en el punto de seguimiento de comprobación M y modifique el nombre de archivo al nombre de tif de punto adecuado. A continuación, haga clic en la pista de nombre de archivo para utilizar el archivo de alfombra de puntos de las pistas y haga clic en ejecutar. En la ventana de la figura utilice la barra de desplazamiento inferior para seleccionar el núcleo.
El núcleo seleccionado se rodeará en rojo, y la trayectoria de la celda seleccionada se puede seguir en el tiempo utilizando la barra de desplazamiento superior. Las cruces verdes indican los núcleos detectados. La proliferación y la diferenciación se ven fuertemente deterioradas en los mioblastos cultivados con Hoechst.
En comparación con los ratones aislados de H2BGFP y cultivados con doxiciclina o tipo salvaje, la cadena pesada de miosina etiquetaba mioblastos. La imagen celular en vivo con mioblastos primarios que expresan la proteína H2BGFP permite el seguimiento de los núcleos durante la diferenciación. Las imágenes combinadas de transmisión en los canales GFP en los puntos de tiempo inicial y final del período de diferenciación, permiten la identificación de miotubos y, en consecuencia, núcleos que terminan integrándose en miotubos o que no se fusionan en miotubos.
Después de la toma de imágenes por microscopía de fluorescencia confocal, los núcleos se pueden segmentar como se demuestra y la transformación de la cuenca hidrográfica se puede utilizar para separar objetos cercanos. Con este enfoque, la mayoría de los núcleos se identifican en la imagen, lo que permite realizar un seguimiento del movimiento de los núcleos como se demuestra. Por ejemplo, parece que la longitud total de las trayectorias es ligeramente mayor para las celdas teñidas con Hoechst.
Aunque la diferencia no es significativa. Sin embargo, el cálculo del desplazamiento total durante un lapso de tiempo revela que el desplazamiento total de las celdas teñidas con Hoechst es significativamente menor que el de las celdas no manchadas. Como se predijo, la variación anual total de las células no manchadas es significativamente menor en comparación con las células teñidas con Hoechst.
Es importante seguir el protocolo exactamente como se ha demostrado en particular al combinar las habilidades técnicas de los pasos biológicos con el microscopio confocal y los pasos utilizados por el software. Para estudiar la diferenciación de mioblastos y el posicionamiento nuclear en otro modelo muscular de interés es posible transferir mioblast aislado con proteína nuclear fluorescente. Esta técnica allanó el camino para explorar la dinámica celular y nuclear durante la diferenciación muscular y para investigar más a fondo los defectos en estos procesos.
Bajo diversas condiciones patológicas como distrofias musculares.
