Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biología química y descubrimiento de fármacos. Por ejemplo, ¿su compuesto se une a la proteína objetivo? Las principales ventajas de esta técnica son que no hay ningún requisito de desprendimiento de las células adherentes.
Y la localización espacial se puede determinar mediante imágenes. Aunque hemos aplicado este método en líneas celulares, también es posible aplicar este método a otros sistemas celulares como cultivos primarios y coculturas. Antes de sembrar las células, coloque placas de ensayo de imágenes negras de 384 biens en una campana de cultivo de tejido y cubra las placas con papel de aluminio antes de usar un taladro estándar para hacer tres agujeros de 3,5 milímetros de diámetro en ambos extremos de cada placa.
Cuando las placas estén listas, utilice una técnica aséptica para lavar un cultivo celular A-431 con 5 a 10 mililitros de PBS. E incubar las células con dos mililitros de tripsina a 37 grados celsius hasta que las células se desprendan. Después de contar, diluir las células a 5 veces 10 a las 4a células por mililitro en medio de cultivo, y sembrar 40 microlitros de células a cada pozo de cada placa de ensayo.
Agitar suavemente cada placa de lado a lado después de la siembra para asegurar una distribución homogénea de las células a través de los fondos de los pozos. Para minimizar los efectos del borde de la placa, permita que las células se asienten en la parte inferior de las placas de ensayo durante 20 minutos a temperatura ambiente en la parte posterior de la campana de flujo laminar antes de colocar las placas en una cámara humidificada personalizada durante dos a tres días a 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono. El día del experimento, utilice una arandela de placas para aspirar el medio de cada pozo.
Y añadir 30 microlitros del compuesto de interés en la concentración experimental adecuada a los pozos experimentales apropiados. Selle las placas de ensayo tratadas con compuestos con sellos de placa transpirables. Y devuelva las placas a la incubadora de cultivo celular durante 30 minutos.
Para exponer las células a un desafío de calor, primero coloque el baño de agua a la temperatura experimental adecuada, y coloque una placa ficticia sin sellar que contenga el mismo volumen de medio por bien como la placa de ensayo en el baño, junto con un termómetro termopar para monitorear la temperatura dentro de los pozos. Cuando se haya alcanzado la temperatura experimental adecuada, retire el sello transpirable de cada placa de ensayo y vuelva a sellar las placas con una lámina de aluminio adhesiva apretada para asegurarse de que no haya fugas de agua en los pozos durante su calentamiento posterior en el baño de agua. Mantener los agujeros perforados dentro del marco de la placa accesibles.
Coloque las placas de ensayo y una nueva placa ficticia en el baño de agua, con la parte inferior de las placas en ángulo hacia la superficie del agua para forzar cualquier aire restante desde debajo de las placas, y comience a monitorear la temperatura de la nueva placa ficticia. Un calentamiento uniforme de la placa es fundamental para el rendimiento del ensayo. Tenga cuidado de colocar la placa en el baño de agua de tal manera que no haya burbujas de aire atrapadas debajo.
Después de tres minutos, enfríe inmediatamente las placas en un segundo baño de agua de agua a temperatura ambiente durante cinco minutos antes de su análisis. Para tomar imágenes de las células, primero agregue 10 microlitros de 16%paraformaldehído directamente a las placas de ensayo para una incubación de 20 minutos a temperatura ambiente. Al final del período de fijación, lave las células con 300 microlitros de PBS en la arandela de placas, y agregue 20 microlitros de 0.1%NP40 para una incubación de 10 minutos a temperatura ambiente.
Al final de la incubación, lave las células como se ha demostrado. Y bloquear las células con 15 microlitros de 1%albúmina sérica bovina, o BSA, durante una hora a temperatura ambiente. A continuación, utilice la arandela de placas para aspirar el suero de bloqueo, y agregue 10 microlitros del anticuerpo primario de interés a los pozos apropiados para una incubación de una hora a temperatura ambiente.
Al final de la incubación, lave cada pocillo con 300 microlitros de PBS y etiquete las células con 10 microlitros del anticuerpo secundario apropiado durante una hora a temperatura ambiente protegidas de la luz. Para la tinción nuclear de las células, agregue 10 microlitros de un tinte nuclear apropiado a cada pozo durante 10 minutos a temperatura ambiente. Y lavar las células en PBS como se demuestra.
Etiquete las células con 10 microlitros de máscara celular por pozo durante 30 minutos a temperatura ambiente. Seguido de un último lavado con PBS. A continuación, dispensar 60 microlitros de PBS fresco a cada pozo, y sellar las placas con papel de aluminio hasta que seinen.
Para crear imágenes de las celdas, capture cuatro imágenes por pozo en un imager de alto contenido utilizando los canales fluorescentes apropiados bajo el objetivo de 10 veces utilizando el enfoque automático láser automatizado y aplique binning durante la adquisición. A continuación, almacene las imágenes como archivos punto-tiff en escala de grises de 16 bits junto con los metadatos. El reconocimiento de anticuerpos no debe ser interrumpido por cambios conformales en la proteína diana que pueden ser inducidos por la unión de ligandos.
Por ejemplo, BIRB796 tiene una tasa de apagado larga y la cuantificación de la interacción de destino solo es posible aplicando un paso de recuperación de antígeno. Este experimento representativo de curva de agregación térmica para células tratadas con compuestos de control positivos y negativos ilustra los rangos típicos de estabilización de proteínas después del tratamiento de las células con los compuestos a varias temperaturas. Aquí se muestra un experimento típico de huellas dactilares de dosis-respuesta isotérmica para demostrar rangos representativos de estabilización de proteínas en respuesta a diferentes dosis de compuesto experimental.
La aplicación de desafíos de calor isotérmico para el cribado compuesto para identificar nuevos aglutinantes de la proteína diana permite el análisis de un gran número de compuestos a una sola concentración a la vez, antes de la huella digital de dosis-respuesta isotérmica de los impactos para confirmar la estabilización de la proteína objetivo. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que las condiciones experimentales exactas, como la longitud y la temperatura del desafío de calor afectan la potencia observada de los compuestos. No olvide que trabajar con paraformaldehído puede ser extremadamente peligroso.
Y siempre se deben tomar precauciones, como seguir las pautas de seguridad institucional, al realizar este procedimiento.
