Este método podría ayudar a responder preguntas clave con respecto a la biología gastrointestinal, como cómo los cambios en la expresión génica o los desafíos ambientales alteran la función intestinal. La principal ventaja de esta técnica es que toma menos tiempo y es más fácil de ejecutar que los métodos tradicionales de medición del tránsito intestinal. El día del ensayo, las larvas son alimentadas con alimentos que contienen una etiqueta fluorescente, y a medida que comen ese alimento, la etiqueta se acumulará en sus intestinos.
Después de la alimentación, se enjuagan, se separan de los alimentos no comidos y cada larva se transfiere a un pozo de un plato de varios pozos. El pozo tiene un fondo cónico para que cuando la materia fecal es anulada, cae al centro del pozo. Ahora recuerde, hay muchas larvas en la placa multi-pozo que se pueden monitorear simultáneamente usando un espectrofotómetro de placas, que mide la cantidad de materia fecal anulada.
Y a medida que más se anula con el tiempo, la señal aumenta en consecuencia. De esta manera, tenemos un método de alto rendimiento para medir el tránsito intestinal. En el cuarto día después de la fertilización, espolvorea dos miligramos de alimento larval en polvo en la parte superior del agua en cada plato de Petri para alimentar a las larvas.
Deje que las larvas se alimenten cuatro horas. Después de alimentar, transfiera todas las larvas a un plato de enjuague grande que contenga un medio embrionario fresco. Usando una pipeta serológica de 50 mililitros, aspira suavemente la mayor cantidad posible de los alimentos sobrantes, teniendo cuidado de no capturar ninguna larva.
Transfiera larvas a un nuevo plato de Petri que contenga 50 mililitros de medio embrionario fresco. Repita el proceso de alimentación, enjuague y transferencia durante dos días adicionales. En el sexto día después de la fertilización, comience a preparar el alimento fluorescente añadiendo 200 miligramos de alimentos secos a un vaso de reloj de 10 centímetros.
Añadir 300 microlitros de etiqueta fluorescente y 100 microlitros de agua desionizada y mezclar brevemente. Esparce la pasta resultante en una capa delgada en el cristal del reloj y deja que se seque a temperatura ambiente, en la oscuridad, durante al menos ocho horas. Después de esto, raspe la mezcla seca del vaso del reloj.
Aplastarlo a un polvo y almacenarlo a temperatura ambiente, en la oscuridad. En el séptimo día después de la fertilización, alimentar el alimento fluorescente a las larvas espolvoretando dos miligramos de él en la parte superior del agua en cada plato de Petri. Deje que las larvas se alimenten durante dos horas.
Mientras tanto, preparar las soluciones de dosificación concentradas disolviendo cada compuesto de ensayo en el medio embrionario a una concentración que es dos veces la dosis objetivo con un volumen final de al menos 2,5 mililitros. Al final del período de alimentación, utilice una pipeta de transferencia para moverlas a un plato de enjuague grande. Enjuague todas las larvas descritas previamente con una aspiradora más estricta.
Es importante eliminar la mayor cantidad posible de alimentos fluorescentes sobrantes durante el enjuague final para reducir la posibilidad de que se transfiera inadvertidamente a la placa de 96 pozos. Después de enjuagar cada larva, utilice una pipeta para retirarla junto con 100 microlitros de medio embrionario del plato de enjuague. Dispensar la larva y los 100 microlitros enteros de medio en un pozo de 96 pocillos, fondo cónico, placa multi-pozo.
Una vez transferidas todas las larvas, añadir 100 microlitros de las soluciones dosificadoras preparadas a los pozos adecuados. Una vez añadidas todas las soluciones de dosificación, cargue la placa en un espectrofotómetro de placas. Mida la fluorescencia de la placa desde la parte inferior, cinco veces en sucesión inmediata, sin agitar la placa.
La lectura más baja de cada pozo se designará como su fluorescencia inicial durante el análisis de datos. Incubar la placa a aproximadamente 28 grados centígrados. Repita el proceso de medición, leyendo la fluorescencia cada 20 minutos durante las primeras dos horas después de la dosificación, y la incubación entre lecturas.
Mida la fluorescencia cada 30 minutos para la tercera y cuarta hora después de la dosificación y luego realice mediciones por hora durante las horas de cinco a ocho. Incubar las larvas a 28 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, lea la fluorescencia las 24 horas después de la dosificación.
Este protocolo utiliza espectrofotometría basada en placas para evaluar el tránsito GI como un reemplazo de alto rendimiento para la microscopía fluorescente. Los resultados representativos que comparan estos dos métodos se generan mediante el análisis de peces tratados de forma idéntica durante un período de 24 horas después de la dosificación. Como se ve aquí, los resultados están altamente correlacionados, con una pendiente negativa porque la microscopía mide la señal de fluorescencia retenida y la espectrofotometría mide la señal transmitida.
El análisis de compuestos con mecanismos dispares revela que en comparación con los controles tratados con vehículos, la atropina y la amitriptilina ralentizan el tránsito GI. Por otro lado, se considera que tegaserod y metoclopramida aceleran el tiempo de tránsito. La eritromicina, que se esperaba que acelerara el tiempo de tránsito basado en la respuesta de los mamíferos, en cambio no tiene ningún efecto en el tiempo de tránsito de peces de cebra.
Un análisis adicional demuestra que la atropina ralentiza el tránsito gastrointestinal, la dosis depende de la dosis en larvas de peces cebra. La dosis más baja probada, 042 micromolares, no tuvo ningún efecto significativo. Mientras que las dos dosis más altas se ven cada una para tener un impacto significativo.
Este método tiene muchas aplicaciones, incluyendo la detección de efectos gastrointestinales tóxicos de medicamentos o candidatos a medicamentos, el modelado de enfermedades, como el síndrome del intestino irritable, el descubrimiento de nuevas terapias para tales enfermedades, así como el descubrimiento de compuestos pro-cinéticos.
