Name: design and synthesis of a reconfigurable dna accordion rack
Uploaded: 2018-08-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Design and Synthesis of a Reconfigurable DNA Accordion Rack at JoVE.com

Esta investigación fue parcialmente financiada por el programa Global del centro de desarrollo de investigación a través de la Fundación de investigación nacional de Korea(NRF) financiado por el Ministerio de ciencia y TIC (MSIT) (2015K1A4A3047345) y Nano· Programa de desarrollo de tecnología de materiales a través de la nacional investigación Fundación de Corea (NRF) financiado por el Ministerio de ciencia y TIC (MSIT) (2012M3A7A9671610). El Instituto de investigación de ingeniería en la Universidad Nacional de Seúl proporcionó instalaciones de investigación para este trabajo. Los autores reconocen con gratitud hacia Yoon Tae-Young (ciencias biológicas, Universidad Nacional de Seúl) en cuanto a la espectroscopia de fluorescencia para el análisis de traste.

1. diseño de 6 por 6 estante de acordeón de ADN con caDNAno14
<ol><li>Descargar e instalar caDNAno 2.0 software14 para el diseño de un rack de acordeón de ADN (caDNAno 2.5 también está disponible en https://github.com/cadnano/cadnano2.5). Abrir caDNAno14 y haga clic en la Herramienta de cuadrado para añadir una nueva pieza con un enrejado de cuadrados.</li>
	<li>Número de cada viga de la parrilla de acordeón y dibujar en el panel izquierdo del enrejado del caDNAno14 (figura 2).</li>
	<li>Haga clic en la herramienta lápiz y dibujar cada haz en el panel derecho modificar el caDNAno14. Rotura de vigas cada 32 bp, que está para las uniones entre vigas adyacentes. Colocar grapas cruces en la misma posición de las articulaciones. Utilice la Herramienta lápiz y la Herramienta insertar en caDNAno14 a las articulaciones adicionales monocatenario crossovers.</li>
	<li>Haga clic en la Herramienta lápiz y conecte las articulaciones. Cada rayo tiene siete articulaciones.</li>
	<li>Generar cruces de andamio para combinar los andamios en el circuito simple utilizando el andamio previamente divulgado enrutamiento algoritmo11. No deje que el dominio obligatorio mínimo entre los filamentos de andamio y grapa de menos de 8 bp (figura 3).</li>
	<li>Colocar los andamios que no se utilizan en la Asamblea en los vértices situados en lados opuestos de la rejilla del acordeón, como se muestra en la figura 3.</li>
	<li>Haga clic en la herramienta de la rotura. Romper las cadenas donde hebras discontinuas son circulares o más de 60 bp.</li>
	<li>Diseño de los cerradura filamentos de la DNA.<ol>
<li>Haga clic en la herramienta de la rotura. Rotura 8 bp de una región de ADN básica para hacer una parte adhesiva y eliminar 8 bp de una región de ADN básica. Hay 18 partes pegajosas (figura 1) en el estante de acordeón de 6 por 6.</li>
		<li>Colocar secuencias inversas complementario a las partes pegajosas en ambos extremos de los hilos de la cerradura y conectarlos por una región puente, que consiste en filamentos de polietileno T de la longitud deseada (figura 1B).</li>
		<li>Para la reconfiguración, añadir 8 bp de las secuencias de punto de apoyo en el extremo de la DNA de cerraduras para el desplazamiento del filamento. La secuencia del punto de apoyo utilizada es en la tabla 2.</li>
		<li>Preparación de hilos de poli A que son inversa complementaria a la región de puente.</li>
		<li>Filamentos de diseño que son inversa complementaria a las cerraduras de la DNA para el experimento de reconfiguración.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Haga clic en la Herramienta de secuencia y haga clic en ADN de andamio. Elegir el andamio estándar M13mp18. Haga clic en la Herramienta de exportar y guardar secuencia en formato csv (tabla 1).</li>
</ol>2. simular la estructura con el oxDNA
<ol><li>Descargar e instalar el oxDNA16,17. El último código fuente está disponible en https://sourceforge.net/projects/oxdna/files/.</li>
	<li>Hacer a partir los archivos de configuración desde el archivo14 de caDNAno usando python script 'cadnano_interface.py', que se proporciona en el paquete de17 oxDNA16,. El uso es el siguiente: 'cadnano_interface.py python cadnano_file.json sq'. Ahora se generan la topología archivo y el archivo de configuración. Nota: El archivo de topología incluye cuántas hebras y nucleótidos en la estructura e información sobre bonos de la columna vertebral-columna vertebral entre los nucleótidos. El archivo de configuración incluye información general como rebotes, energía y tamaño de la caja. Información de orientación como el vector posición, vector de la base de la columna vertebral, vector normal, velocidad y velocidad angular de nucleótidos también está incluido (figura 4).</li>
	<li>Cambiar la información en el archivo de configuración y topología de los caDNAno14 para reflejar la información estructural verdadera de la rejilla de acordeón. Los haces están dispuestos en paralelo cuando se visualizan los archivos de configuración y topología de caDNAno14 . Sin embargo, el acordeón rack es una estructura de enrejado por lo que la distancia entre los nucleótidos de servidumbre son ahora para la simulación (figura 5).<ol>
<li>Gire y mueva cada viga a la estructura deseada. Las nueve columnas de la izquierda en el archivo de configuración están el vector posición, vector de la base de la columna vertebral y vector normal (figura 4). Para girar de un rayo, rotar de posición, vectores base de la columna vertebral y normales usando transformación de rotación. Luego mover una viga cambiando el vector de posición para ubicar como se muestra en la figura 5.</li>
		<li>Relajar la estructura usando el script en el paquete de oxDNA (ver ejemplo en $oxDNA/ejemplos/RELAX_INITIAL_CONFIGURATION para más información).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ejecutar simulación de dinámica molecular para pasos 10 millones mediante el archivo de configuración relajada. El uso es como sigue: '. / oxDNA < input >' guardar los datos cada 5000 o 10000 pasos.</li>
	<li>Visualización Nota: Las estructuras se visualizaron mediante cogli.<ol>
<li>Descargar e instalar la última versión de la cogli (https://sourceforge.net/projects/cogli1/).</li>
		<li>Ejecute la cogli con los archivos de configuración y topología de la simulación de oxDNA. El uso es como sigue: '. / cogli1 -t < archivo topología >< archivo de configuración >'.</li>
		<li>Esconder la caja pulsando b.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. síntesis de la estructura
Nota: El método de síntesis está adaptado desde el anterior protocolo15,18.
<ol><li>Comprar las grapas de ADN diseñadas de un proveedor de oligonucleótidos.</li>
	<li>Ajustar la concentración de estas grapas de ADN a 100 μM con agua libre de nucleasa.<ol>
<li>Cada filamento de la DNA que constituye una estructura de 'estado libre' en un tubo de la piscina y ajustar la concentración a 2 μM de cada filamento.</li>
		<li>Piscina DNA filamentos de longitud y número de sitios de bloqueo en los tubos y ajustar la concentración a 2 μM de cada filamento. 18, 9 y 4 sitios de bloqueo se utilizan. Añadir hebras de A poli que son complementarias a la región de puente en la misma concentración.</li>
		<li>Filamentos de la piscina que son inversa complementaria al ADN cerradura filamentos de longitud en los tubos y ajustan la concentración a 2 μM de cada filamento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar solución de MgCl2 de 300 nM mezclando 70 μL de agua libre de nucleasas y 30 μL de la solución de2 1 μM MgCl. Preparar un 5 x solución de Tris EDTA mezclando 95 μL de agua libre de nucleasas y 5 μL de la solución de Tris EDTA 100 x.</li>
	<li>Añadir 2 μL de la grapa ADN, 1.1 μL de solución de MgCl2 , 2 μL de solución de EDTA Tris, 7,6 μL de agua libre de nucleasas y 7.3 μL de DNA de andamio, de los cuales la concentración es de 110 nM a hacer 20 μL de acción mixta. Establecer la concentración final del andamio ADN a 40 nM, grapa ADN a 200 nM, MgCl2 a 16 mM y Tris EDTA solución 0,5 x.</li>
	<li>Rápidamente calentar la solución mixta en un termociclador a 80 ° C y enfriar a 60 ° C a razón de min 4 ° C y enfriar de 60 º C a 4 ° C a una velocidad de 40 min por ° C.</li>
</ol>4. purificación de la estructura
Nota: Las muestras de todas las estructuras se purificaron antes del análisis. En esta sección, describimos el protocolo de purificación PEG, que es una adaptación de la literatura anterior19. La muestra también puede ser purificada por electroforesis en gel como se describe en la literatura anterior15,18.
<ol><li>Preparar 5 M de NaCl y 100 x Tris-EDTA.</li>
	<li>Preparar precipitación-buffer mezclando 150 μL de PEG 8000, 500 μL de 100 x Tris EDTA y 101 μL de 5 M NaCl y 249 μL de agua libre de nucleasa.</li>
	<li>Preparar el búfer de destino mezclando 5.5 μL de solución 300 nM MgCl2 sección 3.3, 10 μL de solución de EDTA Tris x 5 de la sección 3.3 y 84,5 μL de agua libre de nucleasa.</li>
	<li>Mezcla 20 μL de la estructura sintetizada de la sección 3 y 20 μL de tampón de precipitación de la sección 4.2. Luego girar la acción mixta a 16000 x g a 4 ° C. Quite el sobrenadante y disolver el pellet en el buffer de destino de la sección 4.3.</li>
</ol>5. reconfiguración del acordeón Rack de un «estado libre» a un 'estado bloqueado'
<ol><li>Sintetizar la estructura sin candados de ADN para el experimento de configuración.</li>
	<li>Preparar ADN cerradura filamentos de sección 3.</li>
	<li>Añadir 2 μL de ADN cerradura de manera de la longitud deseada en 20 μL de la estructura sintetizada. Concentración de filamentos de la cerradura de DNA es cinco veces mayor que la estructura.</li>
	<li>Incubar la muestra de 0, 10, 25, 50 o 100 minutos para ver cómo rápida reconfiguración.<ol>
<li>Para la incubación de 100 minutos, incubar la muestra a 50 ° C durante 30 minutos y poco a poco enfriar hasta 25 ° C a una tasa de 0,33 ° C/minuto.</li>
		<li>Para la incubación de 50 minutos, incubar la muestra a 50 ° C durante 15 minutos y enfriar lentamente hasta 25 ° C a una velocidad de 0,66 º C/minuto.</li>
		<li>Para la incubación de 25 minutos, incubar la muestra a 50 ° C 7.5 minutos y poco a poco enfriar hasta 25 ° C a una velocidad de 1,32 ° C/minuto.</li>
		<li>Para la incubación de 10 minutos, incubar la muestra a 50 ° C durante 3 minutos y enfriar lentamente hasta 25 ° C a una velocidad de 3,3 ° C/minuto.</li>
		<li>Para la incubación de 0 minutos, guardar muestra a la derecha de 4 ° C después se agregan hebras de ADN cerraduras.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Justo después del paso de atadura, enfriar rápidamente la muestra a 4 ° C para evitar la desnaturalización no deseada.</li>
</ol>6. reconfiguración del Rack acordeón de un 'estado bloqueado' a un 'estado libre'
<ol><li>Sintetizar la estructura con las cerraduras del ADN de la longitud deseada para el experimento de configuración.</li>
	<li>Preparar el inversos complementarios filamentos de sección 3.</li>
	<li>Añadir 2 μL de filamentos que son inversa complementaria a los hilos de la cerradura de la longitud deseada en 20 μL de la estructura sintetizada. Concentración de filamentos de la cerradura de DNA es cinco veces mayor que la estructura.</li>
	<li>Incubar la muestra de 0, 12, 60, 120, 240 minutos para ver cómo rápida reconfiguración.<ol>
<li>Para el 12, 60, 120, incubación de 240 minutos, calentar rápidamente la muestra a 40 ° C y enfriar lentamente hasta 20 ° C durante el tiempo correspondiente a cada uno. Justo después del paso de desprendimiento, enfriar rápidamente la muestra a 4 ° C para evitar la desnaturalización no deseada.</li>
		<li>Para la incubación de 0 minutos, guardar muestra a la derecha de 4 ° C después de reversas hebras complementarias se agregan.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. proyección de imagen de TEM
Nota: Protocolo imagen TEM es una adaptación de la anterior literatura18,20.
<ol><li>Preparar solución de NaOH de 1.25 M mezclando 87.5 μL de agua libre de nucleasas y 12,5 μL de solución de NaOH de 10 M.</li>
	<li>Añadir 1 μL de solución de NaOH de 1.25 M a 50 μL de la solución de formato de uranilo 2%.</li>
	<li>Vórtice de la solución durante 3 minutos y centrifugar a velocidad máxima durante 3 minutos. Depósito 3 μL de la muestra purificada en la rejilla TEM resplandor-descargado durante 3 minutos y lavar rápidamente con papel de filtro.</li>
	<li>Depósito 7 μL de solución de formato de uranilo preparado durante 30 segundos y Lave rápidamente con papel de filtro.</li>
	<li>Medir la longitud y el ángulo de la estructura de acordeón reflejada por TEM.</li>
</ol>8. análisis del traste
<ol><li>Utilizar Atto 550 y Atto 647N tinte, para que la distancia de Förster es 6.5 nm. Vuelva a colocar 58 grapa y grapa 117 en la tabla 1 con fluorescencia con filamentos. Entonces sintetizar la estructura con fluorescencia con hilos por el método descrito en la sección 3.</li>
	<li>Medir la concentración de la muestra purificada.</li>
	<li>Normalizar la muestra a 10 nM y carga 50 μL para las microplacas de 384 bien.</li>
	<li>Excitar la muestra con tintes donador y aceptor en 550 nm y medir el espectro de fluorescencia de 570 nm y 800 nm con un fluorómetro.</li>
	<li>Medir el espectro de fluorescencia de la muestra sólo donante de la misma manera.</li>
	<li>Excitar los tintes de la muestra de 650 nm y el espectro de fluorescencia y medida de 670 nm y 800 nm. Esto es para medir la concentración del aceptador.</li>
	<li>Obtener las desviaciones estándar, repitiendo el mismo experimento con muestras de tres, que se sintetizan y purificados por separado.</li>
	<li>Calcular la eficiencia de traste con la relación entre un método descrito por la ecuación a continuación21. <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58364/58364eq1.jpg"> DA550: intensidad de la fluorescencia de pico del aceptador de la muestra con donador y aceptor en excitación nm 550. D550: intensidad de la fluorescencia en el rango de emisión del aceptador de la donante sólo muestra excitación nm 550. DA650: intensidad de la fluorescencia de pico del aceptador de la muestra con donador y aceptor en excitación nm 650.</li>
</ol>

<ol>
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Los autores no tienen nada que revelar

Este Protocolo introduce todo el proceso de diseño, simulación, síntesis y análisis de la rejilla acordeón de ADN 2D básica. El diseño modificado y las reglas de la simulación se han descrito porque la regla del diseño de origami de ADN estándar, difiere en cuanto a la rejilla de acordeón de ADN tiene nucleótidos adicionales en los crossovers para flexibilidad14,15. De esta forma, esperamos que el protocolo puede acelerar varias investigaciones utilizando ADN acordeón parrillas. Además, el protocolo descrito puede aplicarse también a otras investigaciones usando nanoestructuras de ADN en lugar de origami de ADN estándar.
Para estructuras que no sean la estructura 2D básica demostrado en el trabajo original de investigación, el diseño puede hacerse con modificaciones del protocolo descrito. En Resumen, una estructura de boxeo-guante-primavera está diseñada cambiando el número de la viga y la longitud desde el modelo básico. También se pueden crear estructuras nanotubular 3D mediante la conexión de ambos extremos de una estructura de estante acordeón 2D. Sin embargo, para simular las estructuras 3D, la posición inicial de las vigas se debe considerar en el espacio 3D y el estado inicial de los rayos se supone que para doblar. Por lo tanto, es necesario más transformación computacional. Investigación de diseño y simulación de varios 2D y 3D ADN acordeón rack estructuras se llevará a cabo mediante el desarrollo del programa asistido por ordenador en el futuro.
Velocidad y repetibilidad de actuación son también factores importantes en el campo de la nanotecnología de ADN dinámico. Estructuras de ADN recientemente dinámicas que responden a externo eléctrico o campo magnético propuesto y operado con alta velocidad22,23. Mientras que la parrilla acordeón de ADN ha permitido la actuación colectiva de múltiples vigas de ADN, la velocidad de reconfiguración no mejoró significativamente desde que la actuación se basa en la dislocación del filamento de ADN. Para otras aplicaciones, respuesta a estímulos externos debe mejorarse optimizando el diseño de la cerradura de ADN o usando otro estímulo externo.
Como un estudio de aplicación de la estructura de acordeón reconfigurable, varios materiales funcionales tales como las moléculas de la droga, nanopartículas, o proteínas pueden fijarse a la estructura. Para esto, las moléculas pueden conectarse a la grapa que existe en la posición deseada. En general, una variedad de estudios de la aplicación puede realizarse a través de este protocolo y sus modificaciones.

Sistemas mecánicos basados en nanoestructuras de ADN o DNA nanomáquinas en1,2,3,4,5 son únicos ya que producen movimiento de nanoescala complejas en 2D y 3D en el nanómetro a Ångström resolución, según varias biomoléculas estímulos2,3,6. Colocando materiales funcionales de estas estructuras y control de sus posiciones, estas estructuras pueden aplicarse a varias áreas. Por ejemplo, nanomáquinas de ADN se han propuesto para un reactor molecular7drogas entrega8y nanoplasmonic sistemas9,10.
Anteriormente, hemos introducido la rejilla acordeón del ADN reconfigurable, que puede manipular una red de nanoescala 2D o 3D de elementos11 (figura 1A). A diferencia de otros ADN nanomáquinas que sólo controlan una serie de elementos, la plataforma puede manipular colectivamente periódicamente vestida de elementos 2D o 3D en diferentes etapas. Anticipamos que una red de reacción química y biológica programable o un sistema de computación molecular se puede construir de nuestro sistema, aumentando el número de elementos controlables. La parrilla de acordeón de ADN es una estructura, en que la red de múltiples vigas de ADN está conectada a las articulaciones compuestas de ADN (figura 1B). Se reconfigura el acordeón rack generado por las vigas de ADN por las cerraduras de la DNA, que hibridan a la parte pegajosa de vigas y cambian el ángulo entre los rayos según la longitud de la parte puente de las esclusas (estado bloqueado). Además, multi-step reconfiguración se demuestra mediante la adición de nuevas cerraduras después de la formación del estado libre por desmontar cerraduras de ADN a través de la cadena basada en el punto de apoyo desplazamiento12,13.
En este protocolo se describe todo el proceso de diseño y síntesis de la rejilla acordeón reconfigurable de ADN. El protocolo incluye el diseño, simulación, wet-lab experimentos y análisis para la síntesis del ADN acordeón de 6 por 6 mallas y una reconfiguración de estos. La estructura de cubierta en el protocolo es el modelo básico de la investigación anterior11 y 65 nm por 65 nanómetro de tamaño, que consta de 14 vigas. En términos de diseño y simulación, el diseño estructural del soporte acordeón es diferente de ADN convencional14,de origami de la15 (es decir, firmemente embalado). Por lo tanto, se han modificado las reglas de diseño y simulación molecular de los métodos tradicionales. Para demostrar, mostramos la técnica de diseño utilizando el enfoque modificado de caDNAno14 y la simulación de la rejilla de acordeón con oxDNA16,17 de scripts adicionales. Por último, se describen ambos protocolos de TEM y traste para análisis de estructuras de rack acordeón configurado.

<table><tbody><tr><td>M13mp18 Single-stranded DNA</td><td>NEB</td><td>N4040s</td><td></td></tr><tr><td>1M MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Solution</td><td>Biosesang</td><td>M2001</td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA buffer</td><td>Biosesang</td><td>T2142</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-Free Water</td><td>Qiagen</td><td>129114</td><td></td></tr><tr><td>5M Sodium Chloride solution</td><td>Biosesang</td><td>s2007</td><td></td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1546605</td><td></td></tr><tr><td>10N NaOH</td><td>Biosesang</td><td>S2038</td><td></td></tr><tr><td>Uranyl formate</td><td>Thomas Science</td><td>C993L42</td><td></td></tr><tr><td>Thermal cycler C1000</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodropic 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEM (LIBRA 120)&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorometer Enspire 2300</td><td>Perkin-Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Labogene</td><td>LZ-1580</td><td></td></tr></tbody></table>

design and synthesis of a reconfigurable dna accordion rack

Sistemas mecánicos basados en nanoestructuras de ADN o DNA nanomáquinas, que producen el movimiento de nanoescala complejas en 2D y 3D en el nanómetro a ångström resolución, muestran gran potencial en diversos campos de la nanotecnología como los reactores moleculares, administración de fármacos, y sistemas de nanoplasmonic. El rack acordeón ADN reconfigurable, que colectivamente se puede manipular una red de nanoescala 2D o 3D de elementos, en múltiples etapas en respuesta a las entradas de ADN, se describe. La plataforma tiene potencial para aumentar el número de elementos que pueden controlar nanomáquinas de ADN de algunos elementos a una escala de red con múltiples etapas de reconfiguración.
En este protocolo se describe todo el proceso experimental de la rejilla de acordeón ADN reconfigurable de mallas de 6 por 6. El protocolo incluye un procedimiento de regla y simulación de diseño de las estructuras y un experimento de wet-lab para la síntesis y reconfiguración. Además, el análisis de la estructura utilizando met (microscopía electrónica de transmisión) y traste (transferencia de energía de resonancia de la fluorescencia) está incluido en el protocolo. Los nuevos métodos de diseño y simulación en este protocolo ayudará a los investigadores utilizar el canasto de acordeón de ADN para más aplicaciones.

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Design and Synthesis of a Reconfigurable DNA Accordion Rack

Describimos el protocolo detallado para el diseño, simulación, wet-lab experimentos y análisis para un rack de acordeón ADN reconfigurable de mallas de 6 por 6.

Diseño y síntesis de un ADN Reconfigurable acordeón Rack

DNA nanostructure-based mechanical systems or DNA nanomachines, which produce complex nanoscale motion in 2D and 3D in the nanometer to &#229;ngstr&#246;m ...

design-and-synthesis-of-a-reconfigurable-dna-accordion-rack

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.0K vistas.  Seoul National University. Describimos el protocolo detallado para el diseño, simulación, wet-lab experimentos y análisis para un rack de acordeón ADN reconfigurable de mallas de 6 por 6.

Video: Design and Synthesis of a Reconfigurable DNA Accordion Rack

Folding and Characterization of a Bio-responsive Robot from DNA Origami

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both stimuli and cargo can be tailored according to specific needs. Here we describe the DNA nanorobot fabrication protocol, with the use of the DNA origami technique. The procedure initiates by mixing short single-strand DNA staples into a stock mixture which is then added to a long, circular, single-strand DNA scaffold in presence of a folding buffer. A standard thermo cycler is programmed to gradually lower the mixing reaction temperature to facilitate the staples-to-scaffold annealing, which is the guiding force behind the folding of the nanorobot. Once the 60 hr folding reaction is complete, excess staples are discarded using a centrifugal filter, followed by visualization via agarose-gel electrophoresis (AGE). Finally, successful fabrication of the nanorobot is verified by transmission electron microscopy (TEM), with the use of uranyl-formate as negative stain.

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here we describe a protocol for the folding of a bio-responsive robot from DNA origami, its purification and negative staining for transmission electron microscopic imaging (TEM).

Plegable y caracterización de un Robot Bio-sensible de ADN Origami

The DNA nanorobot is a hollow hexagonal nanometric device, designed to open in response to specific stimuli and present cargo sequestered inside. Both ...

Investigación

Química

Self-assembly of Complex Two-dimensional Shapes from Single-stranded DNA Tiles

Current methods in DNA nano-architecture have successfully engineered a variety of 2D and 3D structures using principles of self-assembly. In this article, we describe detailed protocols on how to fabricate sophisticated 2D shapes through the self-assembly of uniquely addressable single-stranded DNA tiles which act as molecular pixels on a molecular canvas. Each single-stranded tile (SST) is a 42-nucleotide DNA strand composed of four concatenated modular domains which bind to four neighbors during self-assembly. The molecular canvas is a rectangle structure self-assembled from SSTs. A prescribed complex 2D shape is formed by selecting the constituent molecular pixels (SSTs) from a 310-pixel molecular canvas and then subjecting the corresponding strands to one-pot annealing. Due to the modular nature of the SST approach we demonstrate the scalability, versatility and robustness of this method. Compared with alternative methods, the SST method enables a wider selection of information polymers and sequences through the use of de novo designed and synthesized short DNA strands.

DNA tiling is an effective approach to make programmable nanostructures. We describe the protocols to construct complex two-dimensional shapes by the self-assembly of single-stranded DNA tiles.

Autoensamblaje de formas bidimensionales complejas de una sola hebra de ADN Azulejos

Current methods in DNA nano-architecture have successfully engineered a variety of 2D and 3D structures using principles of self-assembly. In this ...

Designing a Bio-responsive Robot from DNA Origami

Nucleic acids are astonishingly versatile. In addition to their natural role as storage medium for biological information1, they can be utilized in parallel computing2,3 , recognize and bind molecular or cellular targets4,5 , catalyze chemical reactions6,7 , and generate calculated responses in a biological system8,9. Importantly, nucleic acids can be programmed to self-assemble into 2D and 3D structures10-12, enabling the integration of all these remarkable features in a single robot linking the sensing of biological cues to a preset response in order to exert a desired effect.
Creating shapes from nucleic acids was first proposed by Seeman13, and several variations on this theme have since been realized using various techniques11,12,14,15 . However, the most significant is perhaps the one proposed by Rothemund, termed scaffolded DNA origami16. In this technique, the folding of a long (&gt;7,000 bases) single-stranded DNA 'scaffold' is directed to a desired shape by hundreds of short complementary strands termed 'staples'. Folding is carried out by temperature annealing ramp. This technique was successfully demonstrated in the creation of a diverse array of 2D shapes with remarkable precision and robustness. DNA origami was later extended to 3D as well17,18 .
 
The current paper will focus on the caDNAno 2.0 software19 developed by Douglas and colleagues. caDNAno is a robust, user-friendly CAD tool enabling the design of 2D and 3D DNA origami shapes with versatile features. The design process relies on a systematic and accurate abstraction scheme for DNA structures, making it relatively straightforward and efficient.
In this paper we demonstrate the design of a DNA origami nanorobot that has been recently described20. This robot is 'robotic' in the sense that it links sensing to actuation, in order to perform a task. We explain how various sensing schemes can be integrated into the structure, and how this can be relayed to a desired effect. Finally we use Cando21 to simulate the mechanical properties of the designed shape. The concept we discuss can be adapted to multiple tasks and settings.

DNA origami is a powerful method for fabricating precise nanoscale objects by programming the self-assembly of DNA molecules. Here, we describe how DNA origami can be utilized to design a robotic robot capable of sensing biological cues and responding by shape shifting, subsequently relayed to a desired effect.

Diseño de un Robot Bio-respuesta a partir del ADN Origami

Nucleic acids are astonishingly versatile. In addition to their natural role as storage medium for biological information1, they can be utilized in ...

Bioingeniería

DNA Curtains Shed Light on Complex Molecular Systems During Homologous Recombination

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in HR are closely associated with a loss of genome integrity and oncogenic transformation in human cells. HR involves coordinated actions of a complex set of proteins, many of which remain poorly understood. The key aspect of the research described here is a technology called "DNA curtains", a technique which allows for the assembly of aligned DNA molecules on the surface of a microfluidic sample chamber. They can then be visualized by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). DNA curtains was pioneered by our laboratory and allows for direct access to spatiotemporal information at millisecond time scales and nanometer scale resolution, which cannot be easily revealed through other methodologies. A major advantage of DNA curtains is that it simplifies the collection of statistically relevant data from single molecule experiments. This research continues to yield new insights into how cells regulate and preserve genome integrity.

DNA curtains present a novel method for visualizing hundreds or even thousands of DNA-binding proteins in real-time as they interact with DNA molecules aligned on the surface of a microfluidic sample chamber.

Homologous recombination (HR) is important for the repair of double-stranded DNA breaks (DSBs) and stalled replication forks in all organisms. Defects in ...

Genética

Stable DNA Motifs, 1D and 2D Nanostructures Constructed from Small Circular DNA Molecules

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D DNA nanostructures. Over decades, the rapid development of DNA nanotechnology is attributed to the use of linear DNAs as the source materials. For example, the DAO (double crossover, antiparallel, odd half-turns) tile is well-known as a building block for construction of 2D DNA lattices; the core structure of DAO is made from two linear single-stranded (ss) oligonucleotides, like two ropes making a right hand granny&#160;knot. Herein, a new type of DNA tiles called cDAO (coupled DAO) are built using a small circular ss-DNA of c64nt or c84nt (circular 64 or 84 nucleotides) as the scaffold strand and several linear ss-DNAs as the staple strands. Perfect 1D and 2D nanostructures are assembled from cDAO tiles: infinite nanowires, nanospirals, nanotubes, nanoribbons; and finite nano-rectangles. Detailed protocols are described: 1) preparation by T4 ligase and purification by denaturing PAGE (polyacrylamide gel electrophoresis) of small circular oligonucleotides, 2) annealing of stable circular tiles, followed by native PAGE analysis, 3) assembling of infinite 1D nanowires, nanorings, nanospirals, infinite 2D lattices of nanotubes and nanoribbons, and finite 2D nano-rectangles, followed by AFM (Atomic Force Microscopy) imaging. The method is simple, robust, and affordable for most labs.

This article presents a detailed protocol for T4 ligation and denaturing PAGE purification of small circular DNA molecules, annealing and native PAGE analysis of circular tiles, assembling and AFM imaging of 1D and 2D DNA nanostructures, as well as agarose gel electrophoresis and centrifugation purification of finite DNA nanostructures.

Motivos de ADN estable, 1D y 2D nanoestructuras construyen a partir de moléculas de ADN Circular pequeño

This article presents a detailed protocol for synthesis of small circular DNA molecules, annealing of circular DNA motifs, and construction of 1D and 2D ...

DNA Origami-Mediated Substrate Nanopatterning of Inorganic Structures for Sensing Applications

Structural DNA nanotechnology provides a viable route for building from the bottom-up using DNA as construction material. The most common DNA nanofabrication technique is called DNA origami, and it allows high-throughput synthesis of accurate and highly versatile structures with nanometer-level precision. Here, it is shown how the spatial information of DNA origami can be transferred to metallic nanostructures by combining the bottom-up DNA origami with the conventionally used top-down lithography approaches. This allows fabrication of billions of tiny nanostructures in one step onto selected substrates. The method is demonstrated using bowtie DNA origami to create metallic bowtie-shaped antenna structures on silicon nitride or sapphire substrates. The method relies on the selective growth of a silicon oxide layer on top of the origami deposition substrate, thus resulting in a patterning mask for following lithographic steps. These nanostructure-equipped surfaces can be further used as molecular sensors (e.g., surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS)) and in various other optical applications at the visible wavelength range owing to the small feature sizes (sub-10 nm). The technique can be extended to other materials through methodological modifications; therefore, the resulting optically active surfaces may find use in development of metamaterials and metasurfaces.

Here, we describe a protocol to create discrete and accurate inorganic nanostructures on substrates using DNA origami shapes as guiding templates. The method is demonstrated by creating plasmonic gold bowtie-shaped antennas on a transparent substrate (sapphire).

Nanopatrón de nanopatrón de nanopatrón de sustrato mediado por origami de ADN para aplicaciones de cizallamiento

Structural DNA nanotechnology provides a viable route for building from the bottom-up using DNA as construction material. The most common DNA ...

Automated Robotic Liquid Handling Assembly of Modular DNA Devices

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; represented by &#34;devices&#34; created as combinations of individual genetic components. However, manual assembly of such large numbers of devices is time-intensive, error-prone, and costly. The increasing sophistication and scale of synthetic biology research necessitates an efficient, reproducible way to accommodate large-scale, complex, and high throughput device construction.
Here, a DNA assembly protocol using the Type-IIS restriction endonuclease based Modular Cloning (MoClo) technique is automated on two liquid-handling robotic platforms. Automated liquid-handling robots require careful, often times tedious optimization of pipetting parameters for liquids of different viscosities (e.g. enzymes, DNA, water, buffers), as well as explicit programming to ensure correct aspiration and dispensing of DNA parts and reagents. This makes manual script writing for complex assemblies just as problematic as manual DNA assembly, and necessitates a software tool that can automate script generation. To this end, we have developed a web-based software tool, http://mocloassembly.com, for generating combinatorial DNA device libraries from basic DNA parts uploaded as Genbank files. We provide access to the tool, and an export file from our liquid handler software which includes optimized liquid classes, labware parameters, and deck layout. All DNA parts used are available through Addgene, and their digital maps can be accessed via the Boston University BDC ICE Registry. Together, these elements provide a foundation for other organizations to automate modular cloning experiments and similar protocols.
The automated DNA assembly workflow presented here enables the repeatable, automated, high-throughput production of DNA devices, and reduces the risk of human error arising from repetitive manual pipetting. Sequencing data show the automated DNA assembly reactions generated from this workflow are ~95% correct and require as little as 4% as much hands-on time, compared to manual reaction preparation.

Here, an automated workflow to perform modular DNA &#34;device&#34; assembly using a modular cloning DNA assembly method on liquid-handling robots is presented. The protocol uses an intuitive software tool for generating liquid handler picklists for combinatorial DNA device library generation, which we demonstrate using two liquid handling platforms.

Automatizado de montaje robotizada manipulación líquido de dispositivos modulares de la DNA

Recent advances in modular DNA assembly techniques have enabled synthetic biologists to test significantly more of the available &#34;design space&#34; ...

Simple, Affordable, and Modular Patterning of Cells using DNA

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells of the same or different type, micropatterning techniques have proved useful. DNA Programmed Assembly of Cells (DPAC) is a micropatterning technique that targets the adhesion of cells to a substrate or other cells using DNA hybridization. The most basic operations in DPAC begin with decorating cell membranes with lipid-modified oligonucleotides, then flowing them over a substrate that has been patterned with complementary DNA sequences. Cells adhere selectively to the substrate only where they find a complementary DNA sequence. Non-adherent cells are washed away, revealing a pattern of adherent cells. Additional operations include further rounds of cell-substrate or cell-cell adhesion, as well as transferring the patterns formed by DPAC to an embedding hydrogel for long-term culture. Previously, methods for patterning oligonucleotides on surfaces and decorating cells with DNA sequences required specialized equipment and custom DNA synthesis, respectively. We report an updated version of the protocol, utilizing an inexpensive benchtop photolithography setup and commercially available cholesterol modified oligonucleotides (CMOs) deployed using a modular format. CMO-labeled cells adhere with high efficiency to DNA-patterned substrates. This approach can be used to pattern multiple cell types at once with high precision and to create arrays of microtissues embedded within an extracellular matrix. Advantages of this method include its high resolution, ability to embed cells into a three-dimensional microenvironment without disrupting the micropattern, and flexibility in patterning any cell type.

Here we present a protocol to micropattern cells at single-cell resolution using DNA-programmed adhesion. This protocol uses a benchtop photolithography platform to create patterns of DNA oligonucleotides on a glass slide and then labels cell membranes with commercially available complementary oligonucleotides. Hybridization of the oligos results in programmed cell adhesion.

Patrones simples, asequibles y modulares de células utilizando ADN

The relative positioning of cells is a key feature of the microenvironment that organizes cell-cell interactions. To study the interactions between cells ...

DNA-Tethered RNA Polymerase for Programmable In vitro Transcription and Molecular Computation

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work demonstrates that concepts from DNA nanotechnology can be used to program the enzymatic activity of the phage-derived T7 RNA polymerase (RNAP) and build scalable synthetic gene regulatory networks. First, an oligonucleotide-tethered T7 RNAP is engineered via expression of an N-terminally SNAP-tagged RNAP and subsequent chemical coupling of the SNAP-tag with a benzylguanine (BG)-modified oligonucleotide. Next, nucleic-acid strand displacement is used to program polymerase transcription on-demand. In addition, auxiliary nucleic acid assemblies can be used as &#34;artificial transcription factors&#34; to regulate the interactions between the DNA-programmed T7 RNAP with its DNA templates. This in vitro transcription regulatory mechanism can implement a variety of circuit behaviors such as digital logic, feedback, cascading, and multiplexing. The composability of this gene regulatory architecture facilitates design abstraction, standardization, and scaling. These features will enable the rapid prototyping of in vitro&#160;genetic devices for applications such as bio-sensing, disease detection, and data storage.

We describe the engineering of a novel DNA-tethered T7 RNA polymerase to regulate in vitro transcription reactions. We discuss the steps for protein synthesis and characterization, validate proof-of-concept transcriptional regulation, and discuss its applications in molecular computing, diagnostics, and molecular information processing.

ARN polimerasa atado al ADN para transcripción in vitro programable y computación molecular

DNA nanotechnology enables programmable self-assembly of nucleic acids into user-prescribed shapes and dynamics for diverse applications. This work ...

Plasmid-derived DNA Strand Displacement Gates for Implementing Chemical Reaction Networks

DNA nanotechnology requires large amounts of highly pure DNA as an engineering material. Plasmid DNA could meet this need since it is replicated with high fidelity, is readily amplified through bacterial culture and can be stored indefinitely in the form of bacterial glycerol stocks. However, the double-stranded nature of plasmid DNA has so far hindered its efficient use for construction of DNA nanostructures or devices that typically contain single-stranded or branched domains. In recent work, it was found that nicked double stranded DNA (ndsDNA) strand displacement gates could be sourced from plasmid DNA. The following is a protocol that details how these ndsDNA gates can be efficiently encoded in plasmids and can be derived from the plasmids through a small number of enzymatic processing steps. Also given is a protocol for testing ndsDNA gates using fluorescence kinetics measurements. NdsDNA gates can be used to implement arbitrary chemical reaction networks (CRNs) and thus provide a pathway towards the use of the CRN formalism as a prescriptive molecular programming language. To demonstrate this technology, a multi-step reaction cascade with catalytic kinetics is constructed. Further it is shown that plasmid-derived components perform better than identical components assembled from synthetic DNA.

This protocol describes a method for deriving DNA strand displacement gates from plasmids and testing them using fluorescence kinetics measurements. Gates can be modularly composed into multi-component systems to approximate the behavior of formal chemical reaction networks (CRN), demonstrating a new use for CRNs as a molecular programming language.

Plásmido derivado de ADN Strand Displacement Puertas de Redes de reacción de Ejecución Química

DNA nanotechnology requires large amounts of highly pure DNA as an engineering material. Plasmid DNA could meet this need since it is replicated with high ...